EGCG對高糖刺激下體外足細(xì)胞損傷作用機(jī)制研究.pdf

1、研究目的：本課題主要研究氧化應(yīng)激在糖尿病腎病足細(xì)胞損害過程中的作用，作為綠茶主要活性成分EGCG能否通過抗氧化作用來阻止糖尿病腎病的進(jìn)展。本研究以高糖刺激下體外小鼠足細(xì)胞為研究對象，以維生素E為對照，探討EGCG對足細(xì)胞活性氧生成的影響及對NADPH氧化酶各亞基表達(dá)的影響從而探討其作用機(jī)制；不同濃度EGCG對高糖環(huán)境下足細(xì)胞細(xì)胞周期影響和細(xì)胞周期依賴型蛋白激酶抑制劑（CDKIS）表達(dá)的影響以探討其作用機(jī)制；不同濃度EGCG對高糖環(huán)境下足

2、細(xì)胞凋亡的影響，并探討其作用機(jī)制。 研究方法：以高糖刺激下小鼠足細(xì)胞株為為研究對象，以不同濃度EGCG和維生素E干預(yù)后：1. MTT法檢足細(xì)胞活性2.DCFH-DA標(biāo)記熒光探針在激光掃描共聚焦顯微下檢測ROS，流式細(xì)胞儀檢測足細(xì)胞平均熒光強(qiáng)度(mean fluroscent intensity ,MFI)，比較EGCG對高糖環(huán)境下足細(xì)胞活性氧ROS生成的影響3采用相差顯微鏡下觀察足細(xì)胞形態(tài)的改變4.. BrdU ELISA法檢測

3、細(xì)胞增殖和流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期5.Annexin V-FITC法檢測足細(xì)胞凋亡，Hoechst 33258染色激光共聚焦顯微鏡觀察凋亡小體。6. 采用半定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）檢測NADPH氧化酶亞基ph22phoxmRNA、p47phoxmRNA、p67phoxmRNA表達(dá)影響探討活性氧生成機(jī)制；細(xì)胞周期依賴型蛋白激酶抑制劑P21 Cip1mRNA和 P27 KipmRNA1表達(dá)的影響探討對細(xì)胞周期影響；RT-PCR檢

4、測TGF-β1mRNA表達(dá)探討足細(xì)胞凋亡機(jī)制。 研究結(jié)果：1. 高糖刺激下6小時足細(xì)胞活性氧生成增加，正常糖組和甘露醇組培養(yǎng)12小時活性氧生成無顯著差異。EGCG（0.2umol/L）作用6小時可明顯降低高糖環(huán)境下體外小鼠足細(xì)胞活性氧（MFI）水平。EGCG(100umol/L)對NADPH氧化酶亞基p22phox和p67phoxmRNA表達(dá)減少差異顯著，EGCG(0.2umol/L)和維生素E(0.2mmol/L)協(xié)同作用組對

5、p47phoxmRNA減少減少差異顯著。2. 隨刺激葡萄糖濃度上升，部分細(xì)胞脫落，呈不規(guī)則形態(tài)。以正常糖為對照，高糖刺激24小時后，足細(xì)胞增殖差異不顯著，48和72小時后足細(xì)胞增殖減少，差異顯著；以高糖組為對照，高糖刺激24小時，維生素E組和維生素E、EGCG協(xié)同作用組促進(jìn)足細(xì)胞增殖差異顯著，EGCG(0.2,10,100uM)作用組差異無統(tǒng)計學(xué)意義；48小時實驗結(jié)果和24小時相同；72小時 EGCG(100uM）維生素E組和維生素E、

6、EGCG協(xié)同作用組促進(jìn)足細(xì)胞增殖作用差異顯著。不同濃度EGCG干預(yù)24小時足細(xì)胞周期G1/G0期、S期、G2/M期百分比差異不顯著，干預(yù)72小時對足細(xì)胞時足細(xì)胞周期G1/G0期、S期、G2/M期百分比差異顯著；EGCG干預(yù)24小時細(xì)胞周期依賴型蛋白激酶抑制劑P21 Cip1mRNA和 P27 Kip1mRNA表達(dá)無統(tǒng)計學(xué)差異。3. EGCG（20uM）、EGCG（2.0uM）、維生素E及EGCG協(xié)同作用組減少足細(xì)胞早期凋亡比例差異顯著，

7、以高糖組為對照，隨EGCG濃度上升，TGF-β1mRNA表達(dá)下降差異不顯著。 結(jié)論：EGCG能緩解高糖環(huán)境下體外足細(xì)胞氧化應(yīng)激狀態(tài)，對高糖培養(yǎng)下足細(xì)胞有保護(hù)作用，EGCG明顯減少NADPH氧化酶活性可能是高糖環(huán)境下活性氧生成減少的重要機(jī)制；EGCG（100uM）作用72小時促進(jìn)高糖環(huán)境下足細(xì)胞增殖，EGCG（0.2,10,100uM）作用72小時減少足細(xì)胞周期G1/G0期、S期，延長G2/M期,促進(jìn)足細(xì)胞增殖；高糖刺激后24小時