PCR技術檢測嬰兒配方奶粉中坂崎腸桿菌的研究.pdf

1、食品安全突發(fā)事件頻率高是近年來食品安全問題的一個顯著特點，坂崎腸桿菌是自1961年發(fā)現以來一直受全世界的關注的一種食源性致病菌，能在嬰幼兒中引起膿血癥、腦膜炎或壞死性小腸結腸炎特別是對新生兒或免疫力較低的嬰兒，常會導致嚴重的后遺癥甚至死亡。 本文對嬰兒配方奶粉中坂崎腸桿菌的PCR檢測方法進行了研究。 本試驗以坂崎腸桿菌23S rDNA的保守序列，通過NCBI對比，根據其特異區(qū)片斷設計引物。實驗過程中對PCR反應體系中鎂離

2、子濃度、模板量及退火溫度和循環(huán)數等PCR影響要素進行優(yōu)化，確定了適宜的PCR反應體系和擴增程序，其反應體系為：2.5uL 10×PCR buffer(10 mmol/L Tris-HC1[pH 8.3]，50 mmol/L KC1，0.1 ％[wt/vol]gelatin,0.5％Tween 20)，3.0uL25 mmol/LMg<2+>，2.0uLdNTPs混合物，0.5uL 10 uM正向引物，0.5uL 10 uM反向引物，0.

3、25uL，(5U uL<'-1>)Taq酶，模板為FTA膜，水16.25uL，總反應體系25uL；PCR擴增程序為：PCR反應采用冷啟動，94℃預變性5 min，94℃變性1 min，55.6℃退火45 s，72℃延伸1 min，34個循環(huán)，72℃終延伸10 min，反應產物在2％的瓊脂糖凝膠中進行電泳，凝膠成像系統觀察結果。對PCR擴增產物克隆到pMD-18T質粒上進行了DNA測序，PCR擴增產物DNA序列與靶基因序列的同源性達100

4、％，從而證實PCR擴增產物確為目的擴增產物。采用PCR方法共檢測了5株坂崎腸桿菌標準株和1株野生株及19株其它革蘭氏陽性菌和陰性菌，結果表明6株坂崎腸桿菌為陽性結果，其它菌株均為陰性結果，因此本研究選擇的引物特異性強且PCR方法的靈敏度為10<'-9>。 采用了七種坂崎腸桿菌基因組DNA提取方法，通過的比較，找出了一種最簡便、最有力的提取方法。對該七種基因組DNA方法的檢出限、操作過程和增菌時間等多方面進行了比較，確定最低檢出限

5、，依據每種方法檢出限的不同，再次對嬰兒配方奶粉進行污染，找出了每種方法的檢測時間底線，避免了以往過夜培養(yǎng)造成的不必要的時間浪費。結果顯示出利用FTA濾膜裂解坂崎腸桿菌細胞提取菌體DNA優(yōu)于其它六種方法DNA提取方法，整個實驗過程只需8 h就能完成，比傳統增菌時間縮短了12～22 h。 目前，坂崎腸桿菌的檢測還未有國標方法，本實驗與傳統的FDA BAM方法、DFI方法、OK方法進行對比，并通過與VITEK自動生化鑒定系統為鑒定結果

6、進行陽性對照，本試驗共檢驗了35份樣品其試驗結果為：PCR方法檢出率為14.3％，敏感性為80.0％，特異性為96.7％，符合率為94.3％，FFA膜方法檢出時間為8 h，試劑盒法、普通熱裂解法檢出時間為11～12 h，溶劑熱裂解法、溶菌酶解法、普通試劑法、蛋白酶K法檢出時間為12～13 h；FDA BAM方法檢出率為11.4％，敏感性為80.0％，特異性為100％，符合率為97.1％，檢出時間為7 d：DFI方法檢出率為11.4％，敏

7、感性為80％，特異性為100％，符合率為97.1％，檢出時間為5 d；OK方法檢出率為17.1％，敏感性為80.0％，特異性為100％，符合率為91.4％，檢出時間為5 d。四種方法的敏感性相同，PCR方法的特異性略低于BAM方法和DFI方法，但高于OK方法，PCR方法的符合率稍低于BAM方法和DFI方法但高于OK方法，比較之PCR方法檢測時間比其他三種方法大大縮短。總之，利用FTA濾膜，采用PCR技術可只需增菌2 h檢測到嬰兒配方奶粉