水稻脂肪氧化酶RNA干擾載體的構建及轉化水稻進行耐儲藏的研究.pdf

1、糧食安全是一個全球性的戰(zhàn)略問題，是關系到國家乃至世界政治穩(wěn)定和經濟發(fā)展的大事。我國有65％以上的人口以大米為主食，水稻擔當著我國糧食安全的第一重任，而糧食貯備又是其中重要的一環(huán)。我國每年因稻谷陳化問題損失的包括作為食用和種用的稻谷占總產量的3%，造成幾十億元的經濟損失。稻谷在一般貯藏條件下第二年就會產生陳化變質現(xiàn)象，高溫高濕地區(qū)則更快。為此，我國儲備糧通常采用分散分批、定期推陳儲新、輪流更新的方法，耗費了大量的人力、物力和財力。

2、　　近年來的研究表明，稻谷貯藏期間脂質的降解是導致其品質下降并產生陳味的主要原因之一，其中脂氧合酶是脂質降解的關鍵酶。因此從理論上講，lox的缺失可以明顯地阻止脂質過氧化作用，減緩貯藏糧食氧化變質的速度，保持清新氣味，提高耐貯性。
　　通過搜索GenBank數(shù)據(jù)庫，設計引物。通過PCR技術從玉米和水稻DNA中分別克隆了玉米泛素啟動子（Ubi組成型）和水稻種子脂肪氧化酶基因的特異啟動子（SL特異型）、玉米泛素第一個內含子（IN）。從

3、植物真核表達載體 pBI121上克隆終止子NOS。克隆的玉米泛素啟動子與已知的序列同源性為99.6%,其它序列同源性均為100%。通過比對多種植物的lox基因，找到同源性比較高的序列。利用RT-PCR技術從水稻總RNA中克隆得到了一對反向互補序列的lox基因片段（G1和G2）。
　　為了確定我們克隆的玉米泛素啟動子是否有活性。我們用玉米泛素啟動子替代了植物真核表達載體pBI121中的35S啟動子，GUS染色結果顯示此啟動子的活性很

4、高。
　　利用植物真核表達載體 pCAMBIA1301和上述片段，通過構建中間載體的方法，使構建過程簡單化，構建了兩個植物RNAi表達載體，并通過酶切檢測可知構建成功，兩個載體含有如下部分：1) p13UL，含玉米泛素啟動子、含內含子的lox cDNA發(fā)夾結構及潮霉素選擇標記基因hpt;2) p13SL,含水稻種胚脂肪氧化酶基因的特異啟動子、含內含子的lox cDNA發(fā)夾結構及潮霉素選擇標記基因hpt。
　　利用農桿菌轉化法

5、將p13UL和p13SL兩個載體分別轉化到水稻愈傷組織中。得到再生植株，得到的再生植株品系均為中花16號。PCR檢測基因組DNA顯示，轉p13SL載體的14株轉基因植株中得到4株陽性植株，轉p13UL載體的6株轉基因植株中得到3株陽性植株。這說明兩個載體都插入水稻基因組中。
　　為了研究插入基因組的RNAi片段是否可以表達并起到基因敲除的作用，我們利用了傷害可以誘導lox基因大量表達這一特性，對轉入p13UL的陽性轉基因植株進行傷