水稻ABP cDNA克隆、原核表達(dá)及RNA沉默載體構(gòu)建.pdf

1、高等植物中普遍存在的生長素吲哚乙酸(IAA)，對(duì)植物的生長發(fā)育(如植株形態(tài)、器官分化、種子形成等)起著重要的調(diào)節(jié)作用。生長素結(jié)合蛋白(auxin-bindingprotein，ABP)是生長素調(diào)節(jié)過程中信號(hào)傳導(dǎo)的先驅(qū)，它與生長素一起調(diào)節(jié)植物的生長發(fā)育過程，在細(xì)胞中的含量水平既關(guān)系到細(xì)胞的相對(duì)生長，又直接影響細(xì)胞對(duì)生長素的敏感性。 水稻是世界上最重要的糧食作物之一，也是重要的模式植物之一，深入研究水稻ABP基因的功能及其調(diào)控方式并

2、獲得突變材料將為水稻遺傳改良打下堅(jiān)實(shí)基礎(chǔ)。本研究以粳稻同本晴幼苗的RNA為材料，用RACE及重組PCR技術(shù)克隆ABP全長cDNA，并對(duì)其序列進(jìn)行了生物信息學(xué)分析和預(yù)測(cè)。同時(shí)，利用獲得的ABP進(jìn)行了原核表達(dá)載體構(gòu)建及RNA沉默載體構(gòu)建、表達(dá)研究等，為獲得水稻產(chǎn)量、品質(zhì)和抗性方面的突變材料作了一些探索性的工作。主要研究結(jié)果如下： 1、克隆了水稻ABP全長cDNA，測(cè)序結(jié)果已登錄到GenBank，登錄號(hào)為EU595028。該cDNA全

3、長920bp(polyA除外)編碼206個(gè)氨基酸。含有GAGA轉(zhuǎn)錄順式作用元件、核糖體結(jié)合位點(diǎn)(RBS)、polyA加尾信號(hào)、糖皮質(zhì)激素作用位點(diǎn)等轉(zhuǎn)錄因子作用位點(diǎn)。序列分析顯示所得核苷酸序列與玉米生長素結(jié)合蛋白基因(zm-ABP1)的核苷酸序列同源性達(dá)79％，氨基酸序列同源性達(dá)78％，同樣具有3個(gè)氨基酸保守結(jié)構(gòu)域，C端內(nèi)質(zhì)網(wǎng)識(shí)別信號(hào)KDEL，和1個(gè)糖基化位點(diǎn)(NSTF)，表明此基因在不同物種間保守性較高?？缒ゎA(yù)測(cè)分析顯示，水稻ABP在1

4、-44號(hào)氨基酸信號(hào)肽部分存在跨膜區(qū)。因此，推測(cè)水稻ABP可能是一種大量存在于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的分泌型蛋白，且位于質(zhì)膜進(jìn)行信號(hào)傳導(dǎo)時(shí)與其它蛋白錨定。二級(jí)結(jié)構(gòu)與三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)顯示，其功能結(jié)構(gòu)域主要集中于β-片層結(jié)構(gòu)區(qū)域，該區(qū)域與ABP的生物學(xué)功能關(guān)系密切，預(yù)測(cè)綜合分析顯示可形成有效結(jié)合生長素的區(qū)域。 2、分別構(gòu)建包含水稻ABP全長cDNA和編碼框的原核表達(dá)載體，以大腸桿菌BL21(DE3)pLysS為蛋白表達(dá)系統(tǒng)嘗試進(jìn)行了GST融合表達(dá)，以獲得

5、純化的水稻ABP進(jìn)行生化、免疫和蛋白質(zhì)相互作用方面的研究。但經(jīng)誘導(dǎo)時(shí)間和誘導(dǎo)劑濃度梯度多次篩選，并未觀察到與陰性對(duì)照有差異條帶，因此可初步認(rèn)為水稻ABP表達(dá)的條件特殊，不能在此原核表達(dá)系統(tǒng)中有效表達(dá)或者水稻ABP對(duì)大腸桿菌的生長不利導(dǎo)致不能有效表達(dá)。 3、為了能用外界誘導(dǎo)因素調(diào)控植物體內(nèi)的RNA沉默，用來自擬南芥的HSP18.2熱激啟動(dòng)子構(gòu)建熱激誘導(dǎo)型真核表達(dá)載體pCAMBIAl101-HSP，并通過GUS基因的表達(dá)證明此表達(dá)載

6、體能在熱激條件下有效表達(dá)水稻愈傷組織中的外源基因。根據(jù)水稻ABPcDNA序列和水稻基因組序列的比對(duì)結(jié)果，確定了水稻ABP基因的外顯子和內(nèi)含子的位置關(guān)系，通過引物設(shè)計(jì)和重組PCR方法得到以水稻ABP基因內(nèi)含子為莖環(huán)結(jié)構(gòu)，外顯子為反向互補(bǔ)序列的DNA發(fā)央結(jié)構(gòu)片段。在此基礎(chǔ)上構(gòu)建了熱激誘導(dǎo)型的RNA沉默載體pCAMBIA1301-HSP-ABP并轉(zhuǎn)化水稻愈傷組織以獲得水稻ABP基因誘導(dǎo)型缺陷突變材料。轉(zhuǎn)化后的材料死亡，推測(cè)存在可能因ABP缺損