水稻隱花色素基因（Cryptochrome）RNAi表達載體構建與轉化水稻的研究.pdf

1、以載體pSPROK、pCAMBIA1300、pCAMBIA1301及擬南芥基因內含子為材料，通過酶切連接首先構建了一個RNAi工程載體pSC1301-347。然而以pSC1301-347為工具，構建了有關水稻隱花色素基因Cry1a、Cry1b和Cry2的四個RNAi和兩個反義RNA表達載體，分別是pSC1301-347-Cry1a、pSC1301-347一Cry2 、pSC1301-347-Cry1ab 、pSC1301-347-Cry

2、1ab2、pSC1301-347-antiCry1a和pSC1301-347-anticry2，其中前四個為RNAi表達載體，最后兩個為反義RNA表達載體。通過農桿菌介導法，用這些表達載體分別轉化粳稻日本晴水稻，得到200多株不同克隆的Gus陽性植株。經測序分析與轉基因植株分子檢測證明構建的所有表達載體插入序列正確，目的基因片段均已完整地整合于水稻基因組序列。 對T0代轉基因植株的觀察分析，初步認為： 1.隱花色素基因對

3、水稻結實率影響較大。 從已完成一個生命周期的4個RNAi轉基因植株表現來看，植株均能正常抽穗開花，但基本不結實。pSC1301-347-Cry1ab2(V3)和pSC1301-347-Cry1ab(V9)未得到一粒種子，結實率為0；pSC1301-347-Cry1a(V16)和pSC1301-347-Cry2(V19)個別植株得到少量種子。而對照日本晴結實率可達20％-30％。結實率低的原因，除冬天氣候因素和轉基因當代植株生長較

4、為異常之外，推測是因為隱花色素基因被敲除或抑制后，水稻幼穗分化、減數分裂、花藥開裂等某個或某些代謝過程發(fā)生障礙，導致最終不能形成正常有活力的雄蕊。 2.子房膨大，不灌漿。 植株開花后，穎花或者空癟，或者子房膨大不灌漿，內無淀粉等光合產物積累，只有水狀的液態(tài)物質。pSC1301-347-Cry1ab2(V3)和pSC1301-347-Cry1ab(V9)兩個載體的轉基因植株尤其如此。推測在兩個及兩個以上的隱花色素基因表達受

5、到抑制時，淀粉的生物合成或運輸途徑出現障礙。 3.花藥不正常。 雄蕊干癟，顏色暗淡，花粉粒很少，不散粉。pSC1301-347-Cry1ab2(V3)和pSC1301-347-Cry1ab(V9)兩個載體的轉基因植株表現尤甚。推測cryptochrome基因可能參與水稻幼穗分化的某個生理生化代謝過程。 4.植株形態(tài)上的差異。 在福州冬季光照不足的玻璃溫室的環(huán)境條件下，pSC1301-347-Crylab2

6、 (V3)和pSC1301-347-Crylab(V9)轉基因植株明顯表現出一種病態(tài)：株高比pSC1301-347-Cryla(V16)和pSC1301-347-Cry2(V19)稍高，葉色發(fā)黃枯萎，葉片似長而軟。 5.對開花的影響。 pSC1301-347-Crylab2(V3)和pSC1301-347-Crylab(V9)轉基因植株開花時間均比pSC1301-347-Cryla和pSC1301-347-Cry2要遲，

7、因此cry基因與水稻開花有關，且抑制的基因數目越多，對開花似影響越大。 以水稻成熟種子和幼嫩種子為材料，對水稻胚性愈傷誘導及其遺傳轉化進行了研究。結果表明，成熟種子、新鮮成熟種子及幼嫩種子愈傷誘導率均>81％，平均86.67％，其中以新鮮成熟種子愈傷率最高，達96.887％；抗性愈傷率成熟胚為22.21％-40.71％，平均28.49％，幼胚為36.79％-43.21％，平均40％，幼胚的抗性愈傷率高于成熟胚；分化出苗率成熟胚為