小麥胚乳特異性多酚氧化酶基因RNA干擾載體的構(gòu)建及遺傳轉(zhuǎn)化.pdf

1、面粉中的多酚氧化酶是造成面團(tuán)褐變的主要因素之一，通過(guò)轉(zhuǎn)基因技術(shù)阻斷或降低ppo基因的表達(dá)，對(duì)于提高面制品的白度，具有重要意義。而探索和建立具有取材方便、無(wú)受體基因型限制、簡(jiǎn)單高效的農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化體系，是實(shí)現(xiàn)小麥轉(zhuǎn)基因技術(shù)突破的關(guān)鍵。本論文包含兩部分研究?jī)?nèi)容：一是高效農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化體系的建立；二是構(gòu)建小麥胚乳特異表達(dá)的多酚氧化酶(polyphenol oxidase，ppo)基因的RNA干擾載體，并利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)技術(shù)將其轉(zhuǎn)入普通小麥。
　　

2、 1.高效農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化體系的建立 使用取材方便的成熟胚作為轉(zhuǎn)化受體，操作方法簡(jiǎn)單，不經(jīng)過(guò)愈傷組織的過(guò)程，實(shí)驗(yàn)周期短，且陽(yáng)性率高。注射轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)化小麥總陽(yáng)性率為78.1％，穗部陽(yáng)性率為73.2％；針刺轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)化小麥總陽(yáng)性率為59.8％，穗部陽(yáng)性率為51.9％。K35使用針刺法和注射法轉(zhuǎn)化總陽(yáng)性率74.2％，穗部陽(yáng)性率為53.6％；濟(jì)引1號(hào)分別使用針刺法和注射法進(jìn)行轉(zhuǎn)化總陽(yáng)性率65.7％，穗部陽(yáng)性率為76.9％。未萌動(dòng)時(shí)轉(zhuǎn)化陽(yáng)性率為67.7％

3、，穗部陽(yáng)性率為63.6％；籽粒萌動(dòng)時(shí)轉(zhuǎn)化陽(yáng)性率為69.7％，穗部陽(yáng)性率為65.2％；有芽時(shí)轉(zhuǎn)化陽(yáng)性率為72.1％，穗部陽(yáng)性率為65.9％。所以使用濟(jì)引1號(hào)為轉(zhuǎn)化受體，在籽粒有芽時(shí)采用注射法轉(zhuǎn)化效果更好。
　　 2.載體構(gòu)建 本研究選用ppo基因的第三外顯子為靶序列，goujianle含有胚乳特異性啟動(dòng)子Bx17和ppo基因的特異性RNA干擾表達(dá)盒的中間載體pZlbx-ppoRNAi。通過(guò)選用合適的酶切位點(diǎn)，酶切連接構(gòu)建得到中間載

4、體pBluippo和pBluippopBIOS，然后將pBluippopBIOS中含Bx17和ppo基因的RNA干擾表達(dá)盒整合到含Ac/Ds轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)的pBIOS1952載體上，構(gòu)建得到能有效去除篩選標(biāo)記基因的ppo特異性干擾的農(nóng)桿菌表達(dá)載體piPPO。
　　 3.piPPO農(nóng)桿菌載體轉(zhuǎn)化小麥 將含有piPPO載體的農(nóng)桿菌利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)方法對(duì)500個(gè)正在生長(zhǎng)中的幼胚進(jìn)行轉(zhuǎn)化，在幼胚和胚乳間緊密接觸處注入piPPO農(nóng)桿菌菌液，經(jīng)過(guò)