膠質細胞源性神經(jīng)營養(yǎng)因子參與卵泡顆粒細胞增殖的作用研究.pdf

1、膠質細胞源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(glial cell line-derived neurotrophic factor, GDNF)是1993年Lin等發(fā)現(xiàn)的一種新的有活性的神經(jīng)營養(yǎng)因子，近年來，讓生殖屆學者感興趣的是，GDNF不僅可以在外周器官中表達，也可以在卵巢中的表達，且其表達水平尤為突出。在睪丸組織中的表達亦是十分的顯著。卵巢中的神經(jīng)不僅和血管相連，也和卵泡相連接，同時可以發(fā)現(xiàn)異位移植的卵巢組織迅速的長出神經(jīng)纖維。GDNF在卵巢組織中

2、高表達，且分布泌尿系統(tǒng)和成年個體的卵巢中且貫穿整個胚胎發(fā)育階段，主要集中在卵泡的顆粒細胞上。小鼠GDNF的mRNA表達水平隨著卵泡的發(fā)育逐漸的變顯著，直到排卵前達到最高峰?；谏鲜銮闆r，小鼠GDNF基因蛋白主要分布于卵子和顆粒細胞以及間質細胞上。Kawamura等人進行了一項DNA微陣列分析的實驗，也證實了在小鼠中DGNF的重要作用，后續(xù)的實驗表明GDNF的小鼠卵巢中廣泛表達，在卵丘細胞，顆粒細胞和細胞膜細胞中均有表達。無論是新生小鼠還

3、是成年小鼠的卵巢中均有GDNF的mRNA的表達，貫穿整個的發(fā)育階段，主要集中在卵泡中的卵子的間質細胞中，在竇卵泡的卵丘細胞，顆粒細胞和細胞膜細胞中也均有表達。從經(jīng)歷卵母細胞體外成熟培養(yǎng)（IVM）的婦女的卵母細胞的實驗觀察發(fā)現(xiàn)，在卵泡成熟的最后階段內GDNF蛋白在卵巢內的表達范圍是擴大的，主要分布在未受刺激的的顆粒細胞中。逐步的，通過人和各種哺乳動物中所獲得數(shù)據(jù)配對，我們可以總結出GDNF及其受體的表達模式，在成年女性/雌性卵巢內GDNF

4、以旁分泌和自分泌的方式影響卵母細胞和卵丘細胞。雖然對于GDNF在生殖方面的研究已經(jīng)較多，但是人卵巢方面的研究卻仍然很少，有證據(jù)表明人黃素化顆粒細胞核及細胞漿內存在GDNF, GFRa-1, Ret的表達，且FHS和hCG可以增加顆粒細胞中的GDNF的表達，并且以旁分泌的方式促進卵泡成熟。在卵巢組織體外培養(yǎng)的過程中，加入GDNF可以促進卵泡的發(fā)育和成熟，然而對于GDNF直接作用于卵泡以及卵泡顆粒細胞的研究卻仍然較少。
　　本研究以K

5、GN卵泡顆粒細胞和人竇前卵泡為研究對象，觀察GDNF刺激對人竇前卵泡體外培養(yǎng)所起作用，并得出其所起作用的最佳濃度，以該最佳濃度作用卵泡顆粒細胞的體外培養(yǎng)，觀察其卵泡顆粒細胞的增殖變化的作用，對卵泡顆粒細胞體外培養(yǎng)激素水平的影響，以及對卵泡顆粒細胞中FSHR基因表達的影響，初步探討GDNF作用于卵泡的可能作用機制。
　　目的：
　　觀察GDNF對凍融后人竇前卵泡體外發(fā)育的作用；探討GDNF在KGN細胞增殖過程中影響，以及GDN

6、F刺激后KGN細胞基因表達的變化，為臨床應用提供有利的理論和實驗依據(jù)。
　　方法：
　　1.搜集卵巢囊腫手術患者的正常卵巢皮質，采用玻璃化冷凍的方法行冷凍處理，解凍后行酶消化法消化，消化后機械法于鏡下取始基卵泡和初級卵泡，置于FA凝膠內，GDNF刺激，選擇適當濃度，觀察GDNF刺激后體外培養(yǎng)卵泡變化。
　　2.體外培養(yǎng) KGN細胞，傳代入12孔皿后，行爬片處理，采用免疫組化和RT-PCR法檢測其受體GDNF家族受體酪氨

7、酸激酶受體RET(rearranged during transfeetion)的表達。
　　3.體外培養(yǎng)KGN細胞，傳代入96孔皿后，分別給予不同濃度GDNF刺激，觀察24h、48h后做CCK-8刺激后細胞增殖情況。
　　4.體外培養(yǎng)KGN細胞，于6孔皿傳代后，試驗組給予10ng/mlGDNF刺激，24h，48h后分別收集試驗組和控制組液體1ml,檢測2組間雌激素、孕激素變化。
　　5.體外培養(yǎng)KGN細胞，于6孔皿傳

8、代后24h，行饑餓處理6h后，給予1ul含GDNF試劑至試驗組使GDNF濃度為10ng/ml，6h后裂解細胞并提取RNA，做PCR，檢測基因變化。
　　結果：
　　1.經(jīng)膠原酶消化而后采用機械法分離凍融后人卵巢組織片中的竇前卵泡，并將分離后的卵泡置于凝膠中，給予GDNF刺激，10ng/mlGDNF組E2值升高，且顯著高于對照組和1ng/mlGDNF組(P＜0.05)。
　　2.GDNF的受體蛋白RET在顆粒細胞上有表達

9、，定位于胞核和胞漿。
　　3.不同濃度水平的GDNF對顆粒細胞系的生長影響不同：高濃度的GDNF抑制細胞增殖，低濃度的GDNF促進細胞增殖。其中100ng/ml較控制組顯著抑制(P＜0.05)，10ng/ml組則較控制組顯著促進增殖(P＜0.05)。
　　4.10ng/mlGDNF處理 KGN細胞后對顆粒細胞的雌孕激素沒有顯著影響(P>0.05)。
　　5.FSH及其受體mRNA在10ng/mlGDNF刺激后表達有改變

10、，表達量提高(P＜0.05)。
　　結論：
　　1.人竇前卵泡體外培養(yǎng)過程中，在其培養(yǎng)液中加入10ng/mlGDNF，可以促進竇前卵泡的體外發(fā)育。
　　2.GDNF受體RET的mRNA在KGN細胞中有表達，位于細胞核和細胞漿。
　　3.10ng/mlGDNF可以更好的刺激體外培養(yǎng)KGN細胞增殖，而其濃度過大可抑制細胞增殖。
　　4.GDNF體外刺激KGN細胞，雌激素孕激素水平無顯著變化。
　　5.GD