植物雌激素大豆黃酮對雞胚卵巢和成雞卵泡發(fā)育調(diào)控機理的研究.pdf

1、本研究建立了雞胚卵巢生殖細胞一體細胞共培養(yǎng)模型，研究了人參皂甙、促性腺激素和性激素對生殖細胞增殖的調(diào)控及其機理和異黃酮植物雌激素一大豆黃酮對雞胚卵巢生殖細胞增殖的促進作用，并在細胞水平對其作用機理進行了深入探討。同時，以伊莎雞和絲羽烏骨雞為研究對象，在體內(nèi)從整體、分子等不同水平探討了大豆黃酮對雞產(chǎn)蛋性能的影響及其卵泡發(fā)育調(diào)節(jié)機制，其結(jié)果為大豆黃酮在蛋雞生產(chǎn)上的應(yīng)用及提高禽類特別是地方品種禽類的生產(chǎn)性能提供了科學(xué)的理論依據(jù)。 1．

2、雞胚卵巢生殖細胞一體細胞共培養(yǎng)模型的建立及其驗證和應(yīng)用 探索雞胚卵巢生殖細胞分離培養(yǎng)的簡易方法及條件，為深入研究內(nèi)源性激素和異黃酮類植物雌激素對卵巢生殖細胞發(fā)育的影響及其機制提供實驗?zāi)Ｐ?。采用機械分散加膠原酶分解法分離18胚齡雞胚卵巢細胞，體外共培養(yǎng)生殖細胞和體細胞，并用c-kit單克隆抗體進行生殖細胞的鑒定。結(jié)果表明添加10μg/mL胰島素、5μg/mL轉(zhuǎn)鐵蛋白和3×10<'-8>mol/L亞硒酸鈉的培養(yǎng)液(稱ITS培養(yǎng)液)能

3、較好地維持生殖細胞的存活和增殖。此外，采用c-kit免疫細胞化學(xué)方法對生殖細胞進行了特異性鑒定，結(jié)果顯示卵巢生殖細胞呈c-kit染色陽性，而體細胞呈c-kit染色陰性。同時利用該模型研究了人參皂甙(GS)對雞胚卵巢生殖細胞增殖的影響及其信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機制。結(jié)果顯示GS(0.1～10μg/mL)可明顯提高生殖細胞的數(shù)目(P<0.05)，蛋白激酶C(PKC)激活劑Phorbol-12-myristate-13-acetate(PMA，10<'-8

4、>～10<'-8>M)可增強這種促進作用，而PKC抑制劑H<,7>(10<'-7>～10<'-5>M)則減弱了這種促進作用，并都呈現(xiàn)一定的劑量-效應(yīng)關(guān)系。細胞增殖核抗原一標(biāo)記指數(shù)(PCNA-LI)統(tǒng)計結(jié)果顯示出與生殖細胞數(shù)目變化相似的趨勢。以上結(jié)果表明GS能夠促進雞胚卵巢生殖細胞增殖，PKC信號途徑可能參與了GS對卵巢生殖細胞的發(fā)育調(diào)節(jié)。同時實驗進一步證實生殖細胞一體細胞共培養(yǎng)模型可以作為評價激素、激素樣作用的外源性物質(zhì)對卵巢生殖細胞體

5、外增殖調(diào)節(jié)的實驗?zāi)Ｐ汀?2．FSH對雞胚卵巢生殖細胞增殖的影響及其信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機制的研究 利用生殖細胞一體細胞共培養(yǎng)模型研究了FSHX對雞胚卵巢生殖細胞增殖的影響及其信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機制。18胚齡雞胚卵巢細胞在培養(yǎng)的同時用FSH和腺苷酸環(huán)化酶(AC)的激活劑Forskolin(FRSK)、PKA抑制劑H<,89>、PKC激活劑PMA、PKC抑制劑H<,7>單獨或聯(lián)合處理。細胞培養(yǎng)48h后，計數(shù)生殖細胞數(shù)目并用PCNA標(biāo)記增殖細胞，統(tǒng)

6、計生殖細胞的PCNA-LI。結(jié)果顯示FSH(10～1000ng/mL)可明顯提高生殖細胞的數(shù)目(P<0.05)，F(xiàn)RSK(10<'-7>～10<'-5>M)和IPMA(10<'-8>～10<'-6>M)可增強這種促進作用，而H<,89>(10<'-7>～10<'-5>M)和H<,7>(10<'-7>～10<'-5>M)則分別減弱了FSH的促進作用，并都呈現(xiàn)出劑量-效應(yīng)關(guān)系。PCNA-LI統(tǒng)計結(jié)果顯示出與生殖細胞數(shù)目變化相似的趨勢。以上結(jié)

7、果表明FSH能夠促進雞胚卵巢生殖細胞增殖，PKA和PKC信號途徑可能都參與了FSH對卵巢生殖細胞發(fā)育的調(diào)節(jié)。 3．雄激素對培養(yǎng)雞胚卵巢生殖細胞增殖的影響及其作用機理的研究 實驗利用已建立的生殖細胞一體細胞共培養(yǎng)模型研究了雄激素對雞胚卵巢生殖細胞增殖的影響及其作用機理。卵巢細胞培養(yǎng)同時用睪酮(testosterone，T)和雄激素受體阻斷劑F1utamide(FLU)、雌激素受體阻斷劑Tamoxifen(TAM)、芳香化酶

8、抑制劑Letrozole(LET)單獨或聯(lián)合處理。細胞培養(yǎng)48h后，計數(shù)生殖細胞數(shù)目并用PCNA標(biāo)記增殖細胞，統(tǒng)計生殖細胞PCNA-LI。結(jié)果發(fā)現(xiàn)T(10<'-8>～10<'-6>M)明顯提高了生殖細胞的數(shù)目(P<0.05)，這種促進作用可被FLU(10～1000ng/mL)、TAM(10～1000ng/mL)、LET(10<'-9>～10<'-7>M)所阻斷，并呈現(xiàn)一定的劑量-效應(yīng)關(guān)系，PCNA-LI進一步證實了上述結(jié)論。以上結(jié)果表明

9、，生殖細胞-體細胞共培養(yǎng)模型可以作為評價激素對卵巢生殖細胞體外增殖調(diào)節(jié)的實驗?zāi)Ｐ?。T可以通過雄激素樣和雌激素樣兩種作用方式促進雞胚卵巢生殖細胞的增殖。 4．大豆黃酮對雞胚卵巢生殖細胞增殖的影響及其作用機理的研究 利用生殖細胞-體細胞共培養(yǎng)模型研究了植物雌激素大豆黃酮(DAI)對雞胚卵巢生殖細胞增殖作用的雌激素樣作用和抗氧化作用。卵巢細胞培養(yǎng)的同時用DAI和雌激素受體阻斷劑TAM單獨或聯(lián)合處理。處理48h后，計數(shù)生殖細胞的

10、數(shù)目并用PCNA標(biāo)記增殖細胞，統(tǒng)計生殖細胞的PCNA-LI。結(jié)果發(fā)現(xiàn)DAI可顯著提高生殖細胞的數(shù)目(P<0.05)，且這種促進作用可被TAM所阻斷。同時，生殖細胞PCNA-LI與生殖細胞數(shù)目變化呈現(xiàn)相似的趨勢。為了進一步研究DAI的抗氧化作用，卵巢細胞被暴露于次黃嘌呤/黃嘌呤氧化酶活性氧產(chǎn)生系統(tǒng)。通過測定超氧化物歧化酶活力及谷胱甘肽水平的變化對系統(tǒng)抗氧化性能進行了評價。處在活性氧產(chǎn)生系統(tǒng)中的卵巢細胞受到嚴(yán)重損傷，這種損傷可被DAI，DA

11、I+TAM明顯緩解(P<0.05)。這些結(jié)果表明DAI可通過雌激素樣作用促進卵巢生殖細胞增殖，同時可以通過抗氧化特性緩解活性氧引起的細胞毒性作用。 5．大豆黃酮對伊莎雞和絲羽烏骨雞產(chǎn)蛋性能和卵泡發(fā)育相關(guān)基因表達的影響 探討了DAI對伊莎雞和絲羽烏骨雞產(chǎn)蛋性能及不同發(fā)育階段卵泡中相關(guān)基因，包括促性腺激素受體(FSHR、LHR)、芳香化酶(P450arom)和催乳素受體(PRLR)mRNA表達的影響。分別隨機選取16只產(chǎn)蛋后

12、期伊莎雞或絲羽烏骨雞，等分為大豆黃酮組和對照組。對照組飼喂基礎(chǔ)日糧，實驗組在基礎(chǔ)日糧中添加10mg/kgDAI，逐日記錄產(chǎn)蛋個數(shù)、產(chǎn)蛋重，實驗持續(xù)7周。實驗結(jié)束后每組隨機采集20枚蛋，分離蛋白和蛋黃，并稱重；取出小黃卵泡和大白卵泡，分離排卵前卵泡(F1，F(xiàn)2，F(xiàn)3……)的顆粒層，通過相對定量RT-PCR法檢測FSHR、LHR、P450arom和PRLR mRNA表達的相對豐度，同時比較DAI對絲羽烏骨雞和伊莎雞的影響強度。結(jié)果顯示，F(xiàn)S

13、HR、LHR、P450arom、PRLR在伊莎雞/絲羽烏骨雞不同發(fā)育階段卵泡中的表達存在差異，DAI明顯提高了產(chǎn)蛋晚期伊莎雞/絲羽烏骨雞的產(chǎn)蛋率及小黃卵泡、大白卵泡的數(shù)量，顯著降低了絲羽烏骨雞卵泡閉鎖率，平均蛋重及排卵前卵泡數(shù)目也都存在增多趨勢：部分卵泡FSHR、LHR、P450arom和PRLR四種基因mRNA表達的相對豐度顯著增加，絲羽烏骨雞對DAI表現(xiàn)出比伊莎雞更高的敏感性。以上結(jié)果表明，在產(chǎn)蛋后期伊莎雞/絲羽烏骨雞基礎(chǔ)日糧中添加

14、DAI能夠顯著提高產(chǎn)蛋性能和不同發(fā)育階段卵泡數(shù)目，降低卵泡閉鎖率，并且上調(diào)部分卵泡中相關(guān)基因的表達以促進卵泡發(fā)育。 綜上所述，本研究建立了雞胚卵巢生殖細胞一體細胞共培養(yǎng)模型，發(fā)現(xiàn)c-kif可以對生殖細胞進行特異性鑒定。通過人參皂甙、促性腺激素和性激素對生殖細胞增殖的調(diào)控及其機理研究，對該模型進行了有效評價。實驗證實GS能夠促進雞胚卵巢生殖細胞增殖，PKC信號途徑可能參與GS對卵巢生殖細胞發(fā)育調(diào)節(jié)；FSH能夠促進雞胚卵巢生殖細胞增

15、殖，PKA和PKC信號途徑都可能參與了其對卵巢生殖細胞的發(fā)育調(diào)節(jié)；T可以通過雄激素樣和雌激素樣兩種作用方式促進雞胚卵巢生殖細胞的增殖。DAI可通過雌激素樣作用顯著促進卵巢生殖細胞的增殖，且可以通過抗氧化特性緩解活性氧引起的細胞毒性作用；同時，DAI明顯提高了產(chǎn)蛋晚期伊莎雞和絲羽烏骨雞的產(chǎn)蛋性能及不同發(fā)育階段卵泡數(shù)量，顯著降低了絲羽烏骨雞卵泡閉鎖率；顯著上調(diào)了部分卵泡FSHR、LHR、P450arom和PRLR四種基因mRNA的表達水平。