循環(huán)血微小RNA作為急性肺動脈栓塞新型生物標(biāo)志物的實驗研究.pdf

1、心血管系統(tǒng)疾病一直以來嚴(yán)重危害著人類的生命健康，由于冠狀動脈病變和腦血管意外在人群中具有較高的發(fā)病率和病死率，使得這兩種疾病已經(jīng)得到充分的重視，但人們對病死率緊隨這兩者之后的急性肺動脈栓塞(AcutePulmonary Embolism，APE)的認(rèn)識和關(guān)注卻相對比較缺乏。肺栓塞由血栓、脂肪、羊水、空氣等各種栓子阻塞肺動脈系統(tǒng)后導(dǎo)致，其中以血栓栓塞最為常見，血栓來源于靜脈系統(tǒng)和右心，以下肢深靜脈來源最多見。栓子阻塞肺動脈及其分支后引起循

2、環(huán)和呼吸功能障礙，急性肺血栓栓塞造成肺動脈較廣泛阻塞時，可引起肺高壓，嚴(yán)重時導(dǎo)致右心失代償、右心擴大，繼而出現(xiàn)急性肺源性心衰，最終可導(dǎo)致死亡。目前診斷該病的金標(biāo)準(zhǔn)為肺血管造影(Pulmonary Angiography，PA)，該檢查屬于有創(chuàng)檢查，有發(fā)生致命性或嚴(yán)重并發(fā)癥的可能。計算機斷層攝影肺動脈造影術(shù)（Computed Tomographic Pulmonary Angiography，CTPA）是當(dāng)前最常用的APE確診手段，但對于

3、腎功能不全和造影劑過敏的患者，該檢查的應(yīng)用受到限制。循環(huán)血中對APE診斷有一定參考意義的是血漿D-二聚體，但該指標(biāo)敏感性高特異性差，主要用于APE的排除診斷以及患者的危險分層?？傊瓵PE的診斷尚缺乏一種診斷效益高、無創(chuàng)、廣泛適用、可快速獲取結(jié)果的方法。如果能在循環(huán)血中尋找到兼?zhèn)涓呙舾行院吞禺愋缘腁PE診斷標(biāo)志物，將為APE的早期快速診斷帶來新希望。
　　微小RNA（microRNA，miRNA）是一種小分子非編碼RNA，它在轉(zhuǎn)錄后

4、水平對基因表達發(fā)揮調(diào)控作用。研究證實miRNA的表達具有組織和細(xì)胞特異性，在特殊情況下可以釋放入血，脫離細(xì)胞的miRNA通過與蛋白類物質(zhì)或微泡等結(jié)構(gòu)相結(jié)合的形式逃避血液中RNA酶的降解從而穩(wěn)定地存在。這些特征使人們將循環(huán)血中miRNAs水平的改變與某些疾病聯(lián)系起來，miRNAs既可能在疾病發(fā)生發(fā)展的過程中起到了調(diào)控作用，也可能直接由受損的病變組織釋放入血?；谝陨涎芯拷Y(jié)果，學(xué)者們開始探索循環(huán)血miRNAs針對不同的疾病是否具有一定的診斷

5、價值，目前相關(guān)的研究已經(jīng)從腫瘤快速擴展到多個疾病領(lǐng)域。在心血管領(lǐng)域研究較多的是循環(huán)血miRNAs與心肌梗死、心衰等的關(guān)系，既往研究提示miRNAs在心肌梗死的診斷中極具潛力。本實驗的目的在于初步探索循環(huán)血中miRNAs是否具備成為診斷APE的生物標(biāo)志物的潛質(zhì)。
　　一、急性肺動脈栓塞動物模型的建立研究
　　目的:制備急性肺動脈栓塞大鼠模型。
　　方法:
　　1.將SD大鼠隨機分為6小組，分別為:正常組、APE后1

6、h組、3h組、6h組、12h組、24h組，每組n=10。采用經(jīng)頸靜脈自體血栓注入法制備APE動物模型。
　　2.采集各組大鼠的血液樣本和肺組織樣本。
　　3.通過兩種方法驗證模型，分別是:1、觀察APE模型組大鼠建模前后一般情況的改變;2、對比APE模型組與正常組大鼠的肺組織HE染色切片。
　　結(jié)果:APE建模的麻醉成功率為96.55％，栓塞成功率為89.29％。建模后大鼠出現(xiàn)氣急、心率加快、口唇和皮膚紫紺等表現(xiàn)，蘇醒

7、后與造模前相比活動減少，納差，反應(yīng)遲鈍。正常組HE染色切片表現(xiàn)正常，APE組HE染色切片上可見血栓填塞肺動脈血管腔，肺組織不同程度的水腫和炎癥細(xì)胞浸潤，部分肺泡間隔增寬，肺泡壁連續(xù)性破壞，偶可見出血點。
　　結(jié)論:通過選擇合適的實驗動物和造模方法，以及把握好造模過程中的細(xì)節(jié)可以成功建立急性肺動脈栓塞動物模型。
　　二、候選循環(huán)血miRNAs在急性肺動脈栓塞動物模型中表達量的檢測研究
　　目的:檢測候選循環(huán)血miRNAs

8、在APE動物模型中的表達情況，尋找對APE有診斷價值的循環(huán)血miRNAs。
　　方法:
　　1.通過查閱文獻報道結(jié)合本實驗室前期的研究工作篩選循環(huán)血候選miRNAs作為本實驗的檢測目標(biāo)，確定合適的循環(huán)血miRNAs內(nèi)參，標(biāo)化實驗結(jié)果。
　　2.選擇基于SYBR Green熒光染料的實時定量PCR反應(yīng)法，檢測候選miRNAs在APE動物模型中的表達情況及其隨時間動態(tài)變化的趨勢。
　　3.采用ELISA法檢測動物模型

9、血漿中D-二聚體水平及其隨時間的動態(tài)變化趨勢。
　　4.繪制接受者工作曲線(ROC curve)評價循環(huán)血miR-195、miR-486、D-二聚體以及miR-195聯(lián)合D-二聚體對APE動物模型的診斷價值。
　　結(jié)果:
　　1.我們確定了以下13個循環(huán)血miRNAs作為本實驗的候選miRNAs:miR-134、miR-410、miR-195、miR-200c、miR-486、miR-146b、miR-34b、miR-

10、192、miR-363、miR-328、miR-26、miR-101、let-7α。選擇miR-16作為循環(huán)血miRNAs定量PCR的內(nèi)參。
　　2.miR-134、miR-410、miR-200c、miR-34b、miR-363、miR-101信號值過低難以測出; miR-195、miR-192的表達量在APE發(fā)生后呈上升的趨勢，其中miR-195的變化具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01);miR-486、let-7α的表達量在APE

11、發(fā)生后有下降的趨勢;miR-328、miR-26、miR-146的表達量在APE發(fā)生后未見明顯變化;進一步檢測目標(biāo)miRNAs隨時間的變化趨勢，miR-195在APE發(fā)生1h后表達量即顯著升高(P＜0.05)，在APE發(fā)生6～12h時上升至最高，24h后開始下降;miR-486在APE發(fā)生6h后表達量顯著下降(P＜0.05)，APE發(fā)生12h時降到最低，24h時仍然保持在低水平;其余各miRNAs在APE發(fā)生后表達量隨時間的變化不具有統(tǒng)

12、計學(xué)意義。
　　3.D-二聚體的含量在APE發(fā)生后3h時顯著升高（P＜0.05），之后逐漸降低。
　　4.miR-195繪制的ROC曲線下面積為0.956(P＜0.01)，miR-486繪制的ROC曲線面積下為0.740(P＞0.05)，血漿D-二聚體繪制的ROC曲線下面積為0.861（P＜0.05）。當(dāng)miR-195相對表達量為1.706時，其對APE動物模型診斷的特異性為100％，敏感性為80％。miR-195聯(lián)合D-二

13、聚體（APE6h組）繪制的ROC曲線下面積為0.964(P＜0.01)，當(dāng)診斷特異性為100％時，靈敏度為85.7％。
　　結(jié)論:
　　1.循環(huán)血miR-195在急性肺動脈栓塞模型中表達量升高，并且在建模早期即有明顯升高，其含量隨時間呈動態(tài)變化趨勢。循環(huán)血miR-486在急性肺動脈栓塞模型中表達量降低，并且在低水平維持較長時間。
　　2.循環(huán)血miR-195對APE動物模型的診斷價值較高，當(dāng)聯(lián)合D-二聚體的時候診斷效能