黃瓜綠斑駁花葉病毒的RT-LAMP檢測和番茄斑萎病毒的膠體金免疫層析試紙條檢測.pdf

1、植物病毒種類繁多，分布廣泛，絕大多數(shù)經(jīng)濟(jì)作物都因受到病毒病的危害使得植株部分或全部生長異常，嚴(yán)重阻礙植物生長，影響品質(zhì)和降低產(chǎn)量，常見癥狀有枯萎、斑駁和腐爛。據(jù)不完全統(tǒng)計，全世界每年因病毒病破壞就造成了高達(dá)150億美元以上的直接經(jīng)濟(jì)損失。在我國有許多重要的經(jīng)濟(jì)作物，如煙草、西瓜、花卉和多種蔬菜作物，每年因為病毒病所造成的直接經(jīng)濟(jì)損失就高達(dá)10億美元以上。農(nóng)業(yè)病害主要分為真菌、病毒、細(xì)菌。植物病毒是僅次于真菌的病原物，病毒病危害植物與其它

2、的病原物有著顯著的差異:病毒顆粒含有感染性核酸，外披蛋白外殼的實體，它可以借助其它的原因如昆蟲、自然因素或者人為因素造成植物的傷口從而進(jìn)入植物體內(nèi)，并利用植物細(xì)胞內(nèi)的能量、信息和酶系統(tǒng)，完成病毒自己的復(fù)制和增殖，從而對植物造成病害，由于這樣的增殖機(jī)制給病毒病的防治帶來了極大的困難。尤其植物病毒種類多，危害面廣，一旦發(fā)生較難防治，造成較大經(jīng)濟(jì)損失，因此有科學(xué)家稱植物病毒病為植物癌癥。因此本研究通過增強(qiáng)對植物的檢驗檢疫工作來一步防范病害發(fā)生

3、和減少病害損失。
　　黃瓜綠斑駁花葉病毒（Cucumber green mottle mosaic virus，CGMMV）是葫蘆科植物上一個重要的種傳病害，它對葫蘆科作物的損失影響巨大。該病毒屬于我國健在的危險性有害生物，是我國重要的檢疫性病害，目前進(jìn)出口岸的植物檢疫部門常有截獲，并且國內(nèi)少數(shù)地區(qū)也有發(fā)生，該病毒的傳播途徑主要以帶毒種子和機(jī)械傳播為主。本研究根據(jù)CGMMV的外殼蛋白(CP)基因的保守區(qū)段設(shè)計RT-LAMP引物;優(yōu)

4、化CGMMV的RT-LAMP反應(yīng)體系;用優(yōu)化后的RT-LAMP反應(yīng)體系對西瓜葉片中的CGMMV進(jìn)行檢測，并且分析該方法的可靠性、靈敏度和特異性。經(jīng)優(yōu)化后RT-LAMP反應(yīng)體系的參數(shù)為4mM MgCl2和0.8 Mbetaine。當(dāng)溫度在63℃時，RT-LAMP可以特異地檢測出西瓜葉片中的CGMMV，即能擴(kuò)增出特異性的梯形條帶而且不會和其它病毒交叉反應(yīng)。擴(kuò)增的產(chǎn)物還可加入熒光染液在紫外燈下或直接通過肉眼觀察判斷。靈敏度試驗顯示RT-LAM

5、P的靈敏度要高于RT-PCR100倍，并且RT-PCR不能用快速粗提取的RNA作為反應(yīng)模板，然而RT-LAMP就可以。該實驗建立了一種將RNA快速抽提與RT-LAMP相結(jié)合并且高效可靠的用于CGMMV的一步檢測方法。這種RT-LAMP檢測方法對CGMMV檢驗檢疫工作有著很好的應(yīng)用前景，利用這種方法可以有效防止CGMMV這種災(zāi)害性病毒廣泛傳播。
　　番茄斑萎病毒（Tomato spotted wilt virus，TSWV）是布尼亞

6、病毒科（Bunuyaviridae），番茄斑萎病毒屬（Tospovirus）中唯一一個侵染植物的病毒。它在世界各地都有分布，并且對許多經(jīng)濟(jì)作物和植物造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失，加上它難以防治。所以本研究針對這種病毒，通過膠體金免疫層析試紙條技術(shù)來快速診斷和提前預(yù)防。這種技術(shù)具有與ELISA相似的特異性和靈敏度，它是膠體金標(biāo)記技術(shù)和快速免疫斑點(diǎn)法相結(jié)合的產(chǎn)物。該方法的最大的特點(diǎn)就是快速、靈敏、簡單、成本低并且不需要專門的技術(shù)人員和昂貴的儀器，通