黃瓜綠斑駁花葉病毒的分子鑒定及檢測(cè)技術(shù)研究.pdf

1、黃瓜綠斑駁花葉病毒(Cucumber green mottle mosaic virus，CGMMV)是世界上許多國(guó)家和地區(qū)葫蘆科植物上的重要檢疫性病毒，嚴(yán)重威脅著西瓜(Citrullus lanatus)、甜瓜(Cucumis melo)、黃瓜(Cucumis sativus Linn.)等葫蘆科作物的生產(chǎn)。本研究采用采自廣西溫室的帶有黃瓜綠斑駁花葉病毒的黃瓜葉片進(jìn)行摩擦接種繁殖，并利用RT-PCR方法進(jìn)行了檢測(cè)鑒定。同時(shí)，利用RT-

2、PCR方法進(jìn)行編碼區(qū)序列擴(kuò)增，得到了編碼區(qū)序列(6188bp)，并進(jìn)行同源性分析。另外，應(yīng)用病毒檢測(cè)上常用的雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法(DAS-ELISA)、反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)、核酸斑點(diǎn)雜交(NASH)技術(shù)，進(jìn)行了檢測(cè)靈敏度比較研究。主要研究結(jié)果如下： (1)根據(jù)外殼蛋白基因序列保守區(qū)域設(shè)計(jì)了一對(duì)引物，經(jīng)RT-PCR鑒定，證明實(shí)驗(yàn)室保存的黃瓜葉片帶有黃瓜綠斑駁花葉病毒。經(jīng)過(guò)摩擦接種表明，該病毒分離物在葫蘆科植

3、物黃瓜、西瓜、甜瓜、南瓜、福州芋瓠上均產(chǎn)生了系統(tǒng)侵染，在莧色藜上產(chǎn)生局部侵染，不侵染普通煙和心葉煙。這些結(jié)果與前人研究結(jié)果相同。寄主植物接種后進(jìn)行RT-PCR檢測(cè)，結(jié)果表明，從接種病毒的葫蘆科植物上和莧色藜上均擴(kuò)增到該病毒的特異性條帶，而接種病毒的普通煙、心葉煙和健康對(duì)照沒有擴(kuò)增出目的條帶，分子生物學(xué)鑒定跟生物學(xué)鑒定的結(jié)果相一致。 (2)編碼區(qū)全長(zhǎng)序列同源性分析表明本實(shí)驗(yàn)擴(kuò)繁的CGMMV-GX分離物與來(lái)自各地的CGMMV分離物全

4、長(zhǎng)序列的同源性在96％以上，與日本的西瓜株系同源性最高，達(dá)97.3％。從不同分離物CP序列同源性比較得出，本實(shí)驗(yàn)擴(kuò)繁的CGMMV-GX與廣西的分離物CGMMV-GX-G同源性達(dá)100％。CGMMV-GX、CGMMV-GX-G這兩個(gè)病毒分離物CP序列與CGMMV-France、CGMMV-W-Japan分離物的CP序列，只有3個(gè)位點(diǎn)堿基的不同。根據(jù)編碼區(qū)全長(zhǎng)序列和CP基因序列構(gòu)建的進(jìn)化樹來(lái)看，不同地區(qū)的CGMMV分離物在進(jìn)化上存在一定的地

5、域相關(guān)性。 (3)三種檢測(cè)方法靈敏度實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：RT-PCR檢測(cè)靈敏度高于地高辛標(biāo)記的核酸斑點(diǎn)雜交技術(shù)，以血清學(xué)為基礎(chǔ)的DAS-ELISA檢測(cè)靈敏度最低. (4)評(píng)價(jià)三種檢測(cè)方法的優(yōu)缺點(diǎn)得出，核酸斑點(diǎn)雜交技術(shù)在CGMMV檢測(cè)上具有很好的應(yīng)用前景。針對(duì)目前CGMMV的檢疫檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)沒有出臺(tái)，本文探索能否通過(guò)地高辛標(biāo)記的核酸斑點(diǎn)雜交和鑒別寄主生物學(xué)鑒定方法相結(jié)合，來(lái)建立CGMMV檢疫檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)，旨在為檢疫部門鑒定此病毒提供依據(jù)