產(chǎn)單核細(xì)胞李斯特菌PCR檢測(cè)方法的建立及溶血素基因的克隆與表達(dá).pdf

1、產(chǎn)單核細(xì)胞李斯特菌(Listeria monocytogenes，LM)是一種強(qiáng)致病性的食源性病原菌，已被WHO列為4種主要的食源性疾病之一，建立對(duì)該菌的快速、敏感、特異的檢測(cè)方法是目前亟待解決的問題之一。 LM的致病性與多種毒力因子有關(guān)，其中溶血素O(Listeriolysin O，LLO)是該菌的主要毒力因子，它存在于所有的致病性LM中。LLO是一種能結(jié)合膽固醇、可被巰基活化的細(xì)胞溶解素，由hlyA基因編碼。 本研究

2、根據(jù)產(chǎn)單核細(xì)胞李斯特菌hlyA基因設(shè)計(jì)引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，檢測(cè)該方法的特異性和靈敏度。人工污染樣品經(jīng)Half-fraser和Fraser增菌后進(jìn)行PCR檢測(cè)，結(jié)果表明，產(chǎn)單核細(xì)胞李斯特菌擴(kuò)增出234bp的條帶，對(duì)照菌未擴(kuò)增出目的條帶，該方法的靈敏度為104 cfu/mL。人工污染樣品的檢出限為8 cfu/25g。說明PCR方法檢測(cè)食品中產(chǎn)單核細(xì)胞李斯特菌具有快速、特異、敏感等特點(diǎn)，具有較高的實(shí)用價(jià)值。 利用PCR技術(shù)擴(kuò)增產(chǎn)單核

3、細(xì)胞李斯特菌溶血素基因hlyA，將其與pMD18-T載體連接，重組質(zhì)粒經(jīng)酶切、PCR鑒定后命名為pMD18-T-hlyA。重新設(shè)計(jì)帶BamHⅠ和XhoⅠ酶切位點(diǎn)引物，從pMD18-T-rayA擴(kuò)增不含信號(hào)肽序列的目的片斷，與pET32a．載體連接。通過酶切、PCR鑒定及序列測(cè)定后，重組菌pET32a-hlyA用IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，收集菌液進(jìn)行SDS-PAGE，純化后進(jìn)行Western blot和間接ELISA分析。結(jié)果表明，所擴(kuò)增的hty