單核增生性李斯特氏菌溶血素分段表達及單克隆抗體的制備.pdf

1、單核細胞增生李斯特氏菌（Listeria monocytogenes，LM）是一種人畜共患的病菌，并且是重要的食源性病原微生物之一，分布廣泛，易感人群較多，可引起人類和動物的敗血癥、流產(chǎn)、腦膜炎和胃腸炎等臨床癥狀。其中hly基因是李斯特菌的重要的毒力基因，hly編碼形成的蛋白大小約為60ku，稱為溶血素(LLO)，李斯特菌溶血素能溶解多數(shù)哺乳動物的紅細胞，是一種孔形成毒素，能協(xié)助LM進入靶細胞，及逃逸吞噬小體。
　　 本實驗在生

2、物信息學(xué)分析的基礎(chǔ)上，參照hly全基因序列設(shè)計五對特異性引物，應(yīng)用PCR擴增產(chǎn)單核細胞李斯特菌的溶血素基因hly，獲得大小分別約為1600bp、980bp、675bp、540bp、620bp的目的片段，并pMD18-T Simple載體連接，經(jīng)酶切、PCR鑒定、測序鑒定。該基因片段與pET30b表達載體經(jīng)BamHⅠ、XhoⅠ處理后進行連接，并轉(zhuǎn)化BL21感受態(tài)細胞。通過酶切、PCR鑒定及序列測定后，嘗試誘導(dǎo)表達，并保存獲得的陽性表達重組

3、質(zhì)粒，表達結(jié)果發(fā)現(xiàn)分段表達的蛋白全部是以包涵體形式表達，所以嘗試將重組質(zhì)粒與分子伴侶質(zhì)粒pG-KJE8共同轉(zhuǎn)化到BL21中，并用終濃度為1mg/ml L-阿拉伯糖和0.2mmol/L的IPTG進行分步誘導(dǎo)表達。SDS-PAGE電泳分析結(jié)果表明利用分子伴侶的共表達系統(tǒng)，其中重組李斯特菌溶血素蛋白以可溶形式表達。應(yīng)用可溶形式表達的李斯特菌溶血素蛋白進行溶血實驗發(fā)現(xiàn)其具有溶血活性，但是將重組LLO蛋白進行純化后免疫BALB/c小鼠，收集陽性血

4、清進行Western blot及ELISA分析后發(fā)現(xiàn)并不與LM分泌的天然LLO發(fā)生特異性結(jié)合。對LM培養(yǎng)進行培養(yǎng)后，經(jīng)SDS-PAGE分析，在60ku大小存在目的蛋白，并通過溶血實驗驗證此蛋白為LLO蛋白，將LM上清液進行過濾除菌后將其用PEG20000進行濃縮，并用甲醛37℃滅活脫毒后，免疫BALB/c小鼠，免疫兩周后的第7天，將LM上清液進行稀釋后，利用間接ELISA方法確定抗原與血清最佳工作濃度。
　　 細胞融合后，應(yīng)用建

5、立間接ELISA方法將LM上清液稀釋16倍進行包被后，對單抗進行篩選。最終經(jīng)過三次克隆化，成功得到3株雜交瘤細胞，分別命名為5E3、3G7、4B7。這3株雜交瘤細胞能穩(wěn)定分泌抗溶血素(LLO)的單克隆抗體。亞類鑒定結(jié)果5E3、3G7、4B7分泌的單克隆抗體都為IgG1型，Westem blot檢測該單克隆抗體具有很好的反應(yīng)特異性。經(jīng)連續(xù)30代傳代，凍存復(fù)蘇后進行ELISA檢測，存前后OD值相差不大，說明這3株雜交瘤細胞能夠穩(wěn)定分泌特異性