酸敏感離子通道1a對PDGF誘導(dǎo)的肝星狀細胞活化的影響及其可能機制.pdf

1、酸敏感離子通道(ASICs)是一類配體門控性離子通道,能被胞外H+激活,開放的通道對Na+、Ca2+具有通透性。研究表明,ASICs參與一系列以組織酸化為特征的疾病,如炎癥、腦缺血、腫瘤等。前期實驗結(jié)果研究表明在大鼠肝纖維化的肝星狀細胞上存在ASIC1a的高表達,并參與肝星狀細胞的活化過程,但具體機制尚不清楚。為此,本研究選用大鼠肝星狀細胞為研究對象,采用胞外血小板衍生因子(Platelet derived growth factor,

2、PDGF)刺激肝星狀細胞活化體外模型,探討ASIC1a在PDGF誘導(dǎo)的肝星狀細胞活化中發(fā)揮的作用及其可能的分子機制。
　　目的:本研究旨在觀察ASIC1a對血小板衍生生長因子(Platelet derived growth factor,PDGF)誘導(dǎo)肝星狀細胞活化的影響,并探討其作用的分子機制。
　　內(nèi)容:
　　1.觀察PDGF刺激HSCs過程中,ASIC1a和CaMKII的表達變化;
　　2.利用ASIC1a

3、 siRNA建立體外ASIC1a的表達沉默模型并驗證其沉默效率;
　　3.觀察沉默或阻滯ASIC1a后,肝星狀細胞活化指標(biāo)的改變;
　　4.探討ASIC1a在PDGF誘導(dǎo)肝星狀細胞活化過程中作用的分子機制;
　　方法:
　　1.PDGF(0、5、10、20ng/mL),(0、12、24、48h)作用于大鼠肝星狀細胞后,通過Western-blot法檢測ASIC1a和CaMKII的表達。
　　2.采用特異性A

4、SIC1a siRNA建立體外ASIC1a的表達沉默,采用熒光倒置顯微鏡、RT-PCR、實時熒光定量 PCR(q-RT-PCR)及 Western-Blot法檢測特異性 siRNA對ASIC1a的沉默效率及其對ASIC1a mRNA和蛋白的抑制作用;
　　3.選擇HSC-T6細胞株為實驗對象,設(shè)正常組、PDGF模型組(10ng/mL)、電壓門控性 Ca2+通道阻滯劑組(5mM nimodipine,3mMω-conotoxin M

5、VIIC)、PcTx1組(100ng/mL)、特異性ASIC1a SiRNA沉默組、ASIC1a SiRNA沉默的陰性對照組,激光共聚焦技術(shù)檢測胞內(nèi)[Ca2+]i水平;MTT和Transwell法檢測細胞增殖和趨化能力;實時熒光定量 PCR及 Western-Blot法檢測肝星狀細胞活化相關(guān)基因 a-SMA,TGF-b,Col-1,MMP-13,TIMP-1的含量,比較其差異性。
　　4.將 PDGF作用于肝星狀細胞24h后,采用

6、 Western-blot法檢測各組細胞 p38、ERK1/2、JNK的磷酸化水平。
　　結(jié)果:
　　1.PDGF誘導(dǎo)肝星狀活化過程中,ASIC1a和CaMKII蛋白表達呈時間和劑量依賴性,且均在24h,10ng/mL時二者表達量達到最大水平;
　　2.化學(xué)合成的特異性ASIC1a siRNA可成功轉(zhuǎn)染入大鼠肝星狀細胞中,且明顯下調(diào)ASIC1a mRNA和蛋白表達量;
　　3.基因水平干預(yù) ASIC1a表達或阻斷

7、 ASIC1a可導(dǎo)致肝星狀細胞胞內(nèi) Ca2+濃度降低,CaMKII的表達降低,且可抑制PDGF誘導(dǎo)的大鼠肝星狀細胞活化,具體表現(xiàn)為:細胞增殖和趨化能力降低,炎癥因子的表達量下降,膠原沉積減少,基質(zhì)金屬蛋白酶及其抑制劑的比值升高;
　　4.沉默或阻斷ASIC1a可抑制PDGF誘導(dǎo)的ERK1/2及JNK磷酸化水平的升高。
　　結(jié)論:
　　1.ASIC1a和CaMKII參與PDGF誘導(dǎo)肝星狀細胞活化過程;
　　2.AS