鉛對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)酸敏感離子通道表達(dá)影響的研究.pdf

1、目的： 研究鉛對(duì)仔鼠海馬和大鼠膠質(zhì)瘤C6細(xì)胞中酸敏感離子通道（acid-sensingion channel，ASIC）1a、2a和2b mRNA和蛋白表達(dá)的影響，探討鉛神經(jīng)毒作用的分子機(jī)制，為鉛中毒的防制工作提供理論依據(jù)。 方法： 1．鉛對(duì)仔鼠生長(zhǎng)發(fā)育及海馬組織中ASIC1a、2a和2b表達(dá)的影響 孕鼠隨機(jī)分為去離子水對(duì)照組、0．2％和1．0％醋酸鉛（Pb（Ac）2）組，自孕第0d起以自由飲水染鉛。幼鼠

2、出生后，記錄各組仔鼠數(shù)以及體重和身長(zhǎng)。之后經(jīng)哺乳染鉛，斷乳后則自行飲用與其母鼠濃度相同的含鉛水。出生后（PN）8d和50d分別處死仔鼠，原子吸收光譜法測(cè)定腦鉛含量，RT-PCR和Western blot法分別觀察各組仔鼠海馬中ASIC1a、2a和2b的mRNA和蛋白的表達(dá)情況。 2．鉛對(duì)C6細(xì)胞損傷和對(duì)細(xì)胞內(nèi)ASIC1a、2a和2b表達(dá)的影響 正常培養(yǎng)大鼠膠質(zhì)瘤C6細(xì)胞，按0．5μmol/L、5μmol/L、50μmol

3、/L、500μmol/L、1000μmol/L Pb（Ac）2組和生理鹽水對(duì)照組，以MTT實(shí)驗(yàn)觀察鉛對(duì)C6細(xì)胞存活率的影響，LDH釋放實(shí)驗(yàn)觀察鉛對(duì)C6細(xì)胞的損傷作用；之后按5μmol/L、50μmol/L、1000μmol/L，Pb（Ac）2組和生理鹽水對(duì)照組染毒細(xì)胞24h，以流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)鉛致細(xì)胞凋亡情況，Real-time PCR和RT-PCR方法檢測(cè)各組細(xì)胞中ASIC1a、2a和2b的mRNA表達(dá)水平，RT-PCR方法檢測(cè)各組細(xì)胞

4、中蛋白激酶C（PKC）和鈣調(diào)蛋白（CaM）的mRNA表達(dá)水平，Western blot檢測(cè)細(xì)胞中ASIC1a、2a、2b、PKC、CaM的蛋白表達(dá)水平。 結(jié)果： 1．鉛對(duì)仔鼠生長(zhǎng)發(fā)育和海馬組織中ASIC1a、2a和2b表達(dá)的影響 （1）各組間仔鼠數(shù)量比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0．05），對(duì)照組、0．2％和1．0％Pb（Ac）2組仔鼠的體重和身長(zhǎng)逐漸降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0．01）。 （2）0．2％

5、、1．0％Pb（Ac）2組PN8d和50d仔鼠的腦鉛含量均高于相應(yīng)對(duì)照組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0．01）；同劑量組仔鼠PN50d腦鉛含量高于PN8d（P<0．01）。 （3）PN8d和PN50d的1．0％Pb（Ac）2組仔鼠海馬的ASIC1a mRNA相對(duì)表達(dá)量高于對(duì)照組（P<0．01），0．2％和1．0％Pb（Ac）2組仔鼠海馬ASIC1a蛋白相對(duì)表達(dá)量均低于相應(yīng)的對(duì)照組（P<0．01，P<0．05）；PN8d和PN50d

6、的0．2％、1．0％Pb（Ac）2組仔鼠海馬．ASIC2a、ASIC2b的mRNA和蛋白相對(duì)表達(dá)量與相應(yīng)對(duì)照組比較，差異均沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0．05）。上述結(jié)果均由三次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)證明。 2．鉛對(duì)C6細(xì)胞的損傷作用和對(duì)細(xì)胞內(nèi)ASIC1a、2a和2b表達(dá)的影響 （1）MTT結(jié)果顯示，細(xì)胞存活率隨染鉛劑量的增加而降低（P<0．01）；LDH釋放率隨染鉛劑量的增加而增加（P<0．01）；細(xì)胞凋亡率有隨劑量增加的趨勢(shì)，但與對(duì)照組的

7、差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0．05）。 （2）1000μmol/L，Pb（Ac）2組ASIC1a mRNA的表達(dá)較對(duì)照組升高（P<0．01）；各劑量組ASIC2a和ASIC2b mRNA表達(dá)水平與對(duì)照組相比，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0．05）；50μmol/L和1000μmol/L Pb（Ac）2組C6細(xì)胞的ASIC1a蛋白表達(dá)較對(duì)照組降低（P>0．01），并呈隨染鉛劑量增加而降低的趨勢(shì)；鉛不影響ASIC2a和ASIC2b蛋白的表

8、達(dá)（P>0．05）。 （3）自5μmol/L Pb（Ac）2組開始，PKC和CaM mRNA和蛋白表達(dá)水平隨劑量增加而降低（P<0．05，P<0．01）。 結(jié)論： 1．動(dòng)物實(shí)驗(yàn)顯示，對(duì)孕哺乳期母鼠染鉛，仔鼠的生長(zhǎng)發(fā)育受到影響，且鉛可以在仔鼠的腦部蓄積，并改變不同發(fā)育時(shí)期仔鼠海馬部位的ASIC1amRNA和蛋白表達(dá)水平。結(jié)合前期行為學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，ASIC1a表達(dá)改變可能是鉛產(chǎn)生神經(jīng)毒性的機(jī)制之一。 2．細(xì)胞實(shí)

9、驗(yàn)顯示，鉛對(duì)大鼠膠質(zhì)瘤C6細(xì)胞具有毒性作用，使細(xì)胞增殖活力下降，細(xì)胞膜受損；同時(shí)鉛干擾C6細(xì)胞中ASIC1a的mRNA和蛋白表達(dá)水平，證實(shí)了動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的結(jié)論。 3．鉛對(duì)CNS ASICs表達(dá)的影響具有-1a亞基特異性。 4．PKC/CaM-ASICs途徑可能構(gòu)成了一條新的鉛神經(jīng)毒作用通路。 綜上所述，本研究經(jīng)體內(nèi)體外實(shí)驗(yàn)相互佐證，從mRNA和蛋白水平上探討了鉛對(duì)ASICs的影響，證實(shí)鉛對(duì)ASIC1a表達(dá)的選擇性干擾