酸敏感離子通道1a在骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞修復(fù)退變椎間盤(pán)中的作用機(jī)制研究.pdf

1、本課題試圖研究以下四個(gè)部分:
　　第一部分:BMSC移植治療兔椎間盤(pán)退變
　　第二部分:大鼠BMSC和髓核組織中ASIC1a的表達(dá)
　　第三部分:ASIC1a在酸性環(huán)境中激活，并介導(dǎo)BMSC的損害
　　第四部分:ASIC1a激活后引起B(yǎng)MSC損傷的機(jī)制探索
　　第一部分:BMSC移植治療兔椎間盤(pán)退變
　　目的:探討B(tài)MSC對(duì)退變椎間盤(pán)的修復(fù)效率。
　　方法:采用經(jīng)典的髓核抽吸法建立兔椎間盤(pán)退變模

2、型。密度梯度法分離培養(yǎng)兔BMSC，三系分化鑒定。在造模后2周移植BMSC，采用病理學(xué)和影像學(xué)評(píng)價(jià)椎間盤(pán)的修復(fù)。檢測(cè)細(xì)胞移植后2，6，10周髓核T2WI信號(hào)強(qiáng)度，T2弛豫時(shí)間，椎間盤(pán)高度指數(shù)及細(xì)胞外基質(zhì)表達(dá)變化。
　　結(jié)果:本研究采用經(jīng)典的髓核抽吸法建立兔椎間盤(pán)退變模型，從腰椎前外側(cè)入路暴露白色的椎間盤(pán)纖維環(huán)，手術(shù)技術(shù)成熟，術(shù)中出血少，術(shù)野清晰，術(shù)后恢復(fù)理想。正常髓核組織中細(xì)胞和細(xì)胞外基質(zhì)分布較均勻，髓核細(xì)胞呈圓形，呈散在的單個(gè)細(xì)胞

3、分布，位于細(xì)胞外基質(zhì)形成的龕室中;退變髓核中細(xì)胞成簇狀，分布不均，細(xì)胞外基質(zhì)紊亂，分界不清。正常纖維環(huán)層狀分布，結(jié)構(gòu)清晰，層與層之間無(wú)髓核細(xì)胞外基質(zhì)嵌入，纖維環(huán)細(xì)，胞大多呈梭形;退變纖維環(huán)層狀結(jié)構(gòu)排列紊亂和撕裂，髓核基質(zhì)和細(xì)胞嵌入纖維環(huán)。造模2周后手術(shù)節(jié)段(L3/4，L4/5，L5/6)椎間盤(pán)T2信號(hào)強(qiáng)度減低。移植手術(shù)后2，6，10周，BMSC組T2信號(hào)強(qiáng)度逐漸升高，與PBS組相比具有明顯的差異，但是依然沒(méi)有達(dá)到正常水準(zhǔn)。造模2周后造模

4、組（包括BMSC組，PBS組和Sham組）的椎間盤(pán)高度指數(shù)(％DHI)明顯低于正常組。移植后2周和6周BMSC組與PBS組相比較，％DHI無(wú)明顯差異;移植后10周BMSC組％DHI值高于PBS組，但依舊呈下降趨勢(shì)。造模2周后手術(shù)節(jié)段椎間盤(pán)T2弛豫時(shí)間減低。移植手術(shù)后2，6，10周，BMSC組的T2弛豫時(shí)間逐漸升高，并且在術(shù)后6和10周時(shí)間點(diǎn)明顯高于PBS組，但是依然沒(méi)有達(dá)到正常水準(zhǔn)。RT-PCR結(jié)果顯示造模2周后椎間盤(pán)髓核區(qū)ACAN和C

5、OL2的表達(dá)量比正常組低。在移植手術(shù)后2，6，10周時(shí)間點(diǎn)，BMSC組髓核區(qū)ACAN和COL2的表達(dá)量逐漸升高。
　　結(jié)論:BMSC移植對(duì)兔退變椎間盤(pán)有一定的修復(fù)作用，增加細(xì)胞外基質(zhì)的表達(dá)，減緩椎間盤(pán)高度的丟失。但椎間盤(pán)高度依然呈進(jìn)行性降低，細(xì)胞外基質(zhì)的表達(dá)也明顯比正常水平低，因此，BMSC移植能在一定程度上修復(fù)椎間盤(pán)退變，但是修復(fù)效率有待提高。
　　第二部分:大鼠BMSC和髓核組織中ASIC1a的表達(dá)
　　目的:檢測(cè)

6、大鼠BMSC和髓核組織中ASIC1a的表達(dá)及其表達(dá)量與退變的關(guān)系。
　　方法:分離培養(yǎng)大鼠BMSC和髓核細(xì)胞。采用Real time RT-PCR、Western blot、免疫組織化學(xué)染色檢測(cè)大鼠BMSC和髓核組織中ASIC1a的表達(dá)，比較正常與退變（50周齡老年大鼠）髓核組織中ASIC1a表達(dá)量的差異，檢測(cè)與原代退變髓核細(xì)胞共培養(yǎng)后的BMSC中ASIC1a的表達(dá)量變化。
　　結(jié)果:酶消化分離獲得的大鼠髓核細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)，呈

7、多角形。甲苯胺藍(lán)染色示髓核細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)有被染成藍(lán)色的蛋白多糖，分布均勻。COL2免疫熒光染色示胞漿內(nèi)顆粒狀陽(yáng)性，COL2主要分布在胞漿里，近核處明顯，呈顆粒狀。密度梯度離心法分離獲得的BMSC貼壁后呈團(tuán)簇樣生長(zhǎng)，放射狀排列，形成集落。BMSC經(jīng)誘導(dǎo)后具有成骨、成軟骨、成脂分化能力。流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)BMSC表面CD29、CD90、CD44陽(yáng)性，CD34、CD45陰性。Real time RT-PCR，Western Blot，免疫組化結(jié)果

8、顯示大鼠髓核組織和BMSC均表達(dá)ASIC1a，與12周齡大鼠相比，50周齡大鼠的髓核組織中ASIC1a的表達(dá)增多。BMSC與50周齡大鼠髓核細(xì)胞共培養(yǎng)后，ASIC1a的表達(dá)量增加。
　　結(jié)論:大鼠髓核組織和BMSC均表達(dá)ASIC1a，且在退變髓核中，ASIC1a的表達(dá)明顯增加。BMSC在體外與退變髓核細(xì)胞共培養(yǎng)后ASIC1a表達(dá)量增加。
　　第三部分:ASIC1a在酸性環(huán)境中激活，并介導(dǎo)BMSC的損害
　　目的:在體外

9、模擬的椎間盤(pán)酸性環(huán)境中，檢測(cè)ASIC1a的激活及介導(dǎo)的BMSC損害。
　　方法:利用Fura-2/Am探針檢測(cè)ASIC1a在酸性環(huán)境下的激活，MTT法、Ki67免疫熒光染色評(píng)價(jià)ASIC1a的激活對(duì)BMSC活力和增殖的影響，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)ASIC1a的激活對(duì)BMSC細(xì)胞周期和凋亡的影響，TUNEL法評(píng)價(jià)細(xì)胞凋亡。同時(shí)，利用ASIC1a特異性阻斷劑PcTX1作用后觀(guān)察BMSC在酸性環(huán)境中的轉(zhuǎn)歸。
　　結(jié)果:在pH7.4時(shí)，細(xì)胞內(nèi)

10、Ca2+濃度比較低，處于一個(gè)穩(wěn)定的基線(xiàn)值，當(dāng)pH6.0的酸性溶液刺激時(shí)，BMSC表面ASIC1a發(fā)生激活，細(xì)胞膜對(duì)Ca2+通透性顯著增加，引起Ca2+內(nèi)流。在不含Ca2+的培養(yǎng)體系中或用ASIC1a特異性阻斷劑PcTX1作用后細(xì)胞內(nèi)Ca2+內(nèi)流減少，即ASIC1a的激活減弱。MTT實(shí)驗(yàn)顯示，BMSC在酸性環(huán)境下的存活率降低，而用PcTX1阻斷ASIC1a后細(xì)胞的存活率增加。流式細(xì)胞術(shù)測(cè)細(xì)胞周期的結(jié)果顯示，沒(méi)有PcTX1干預(yù)的情況下，G1

11、期細(xì)胞比例隨著pH值的降低而增加;在PcTX1干預(yù)的情況下，各組G1期細(xì)胞比例降低，細(xì)胞周期阻滯程度減輕。與pH7.4組相比，酸性刺激組(pH6.0) Ki67的表達(dá)減少，說(shuō)明細(xì)胞的增殖能力減弱。PcTX1干預(yù)組Ki67的表達(dá)率比酸性刺激組高，說(shuō)明阻斷ASIC1a后能提升BMSC在酸性環(huán)境下的增殖能力。流式細(xì)胞術(shù)測(cè)細(xì)胞凋亡率的結(jié)果顯示，在沒(méi)有PcTX1干預(yù)的情況下，凋亡細(xì)胞比例隨著pH值的降低而增加;在PcTX1干預(yù)的情況下，各組凋亡細(xì)

12、胞比例降低。與pH7.4組相比，酸性刺激組(pH6.0) TUNEL陽(yáng)性率增加。PcTX1干預(yù)組TUNEL陽(yáng)性率比酸性刺激組低，說(shuō)明阻斷ASIC1a后能減少BMSC在酸性環(huán)境下的凋亡。
　　結(jié)論:在酸性環(huán)境中，BMSC表面ASIC1a被激活，引起細(xì)胞膜對(duì)Ca2+通透性顯著增加，大量Ca2+內(nèi)流，導(dǎo)致細(xì)胞因鈣超載而損傷，用特異性的ASIC1a通道阻斷劑PcTX1作用后，細(xì)胞存活率增加。
　　第四部分:ASIC1a激活后引起B(yǎng)M

13、SC損傷的機(jī)制探索
　　目的:探索ASIC1a激活后引起B(yǎng)MSC損傷的機(jī)制。
　　方法:用相關(guān)試劑盒檢測(cè)ASIC1a激活后BMSC中鈣蛋白酶和鈣調(diào)磷酸酶的活性，透射電鏡觀(guān)察線(xiàn)粒體的病理變化，Western blot檢測(cè)BAD的磷酸化水平及凋亡通路蛋白caspase8，9，3的活化。
　　結(jié)果:在含Ca2+的pH6.0環(huán)境下(pH6.0組)，BMSC的活力明顯下降，與正常組(pH7.4組)對(duì)比差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。在不含C

14、a2+的pH6.0環(huán)境下(pH6.0+Ca2+ free組)，OD值比pH6.0組高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。PcTX1阻斷ASIC1a后能減輕BMSC的酸性應(yīng)激損傷，pH6.0組與pH6.0+ PcTX1組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。在pH6.0環(huán)境下鈣蛋白酶活性增加，在12h時(shí)達(dá)到峰值，接著有所回降，酸性刺激2h，6h，12h，18h后與基線(xiàn)(0 h)相比，差異都具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。PcTX1和鈣蛋白酶抑制劑Calpeptin的作用能明顯抑制鈣蛋

15、白酶活性的增加。在pH6.0環(huán)境下鈣調(diào)磷酸酶活性增加，在24 h的觀(guān)測(cè)時(shí)間內(nèi)呈逐漸增加趨勢(shì)，酸性刺激2h，6h，12h，18h，24h后與基線(xiàn)(0h)相比，差異都具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。PcTX1、Calpeptin和鈣調(diào)磷酸酶抑制劑CsA的干預(yù)能明顯抑制鈣調(diào)磷酸酶活性的增加。ASIC1a阻斷后，能抑制酸性應(yīng)激環(huán)境下的pBAD去磷酸化，pBAD的表達(dá)量增加。CsA能通過(guò)抑制鈣調(diào)磷酸酶活性減少ASIC1a激活引起的pBAD去磷酸化。在pH6.0組

16、caspase9，caspase3活化增加，而ASIC1a阻斷后，兩者活化程度降低。CsA能通過(guò)抑制鈣調(diào)磷酸酶活性減少ASIC1a激活引起的caspase9，caspase3活化。電鏡結(jié)果顯示，線(xiàn)粒體在pH6.0組出現(xiàn)腫脹，線(xiàn)粒體嵴減少或消失，而用PcTX1阻斷ASIC1a，或Calpeptin和CsA分別抑制鈣蛋白酶和鈣調(diào)磷酸酶活性后，線(xiàn)粒體腫脹程度有所減輕。
　　結(jié)論:細(xì)胞外H+濃度的增高激活BMSC膜上ASIC1a，激活后的