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文檔簡介
1、酸敏感離子通道(Acid sensing ion channels, ASICs),屬于退化因子/上皮鈉通道(degenerin/epithelial sodium channel, DEG/ENaC)超家族中的一員,在酸性條件下能夠被H+活化,通道開放。到目前為止,在哺乳動物中至少有7個ASIC亞基(ASIC1a, ASIC1b, ASIC1b2, ASIC2a, ASIC2b, ASIC3, ASIC4)已被克隆及鑒定。局部組織酸化
2、可以激活A(yù)SICs,進(jìn)而導(dǎo)致疾病的發(fā)生,ASICs很可能在組織酸化相關(guān)疾病中發(fā)揮關(guān)鍵作用。越來越多的研究表明,在ASIC亞基中,ASIC1a在伴隨著局部組織酸化的疾病如腫瘤、炎癥、癲癇及腦缺血等發(fā)生發(fā)展過程中扮演者重要角色,阻斷ASIC1a具有一定程度的保護(hù)作用,而現(xiàn)在仍缺乏高效、選擇性強的小分子ASIC1a抑制劑。為此,本研究通過先合成可能具有抑制ASIC1a的化合物,再以大鼠關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞為研究對象,探討化合物對大鼠關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞中AS
3、IC1a蛋白表達(dá)及功能的影響。
目的:
合成ASIC1a抑制劑(6-Styryl-naphthalene-2-amidrazone derivatives)以及體外觀察其對大鼠關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞中ASIC1a表達(dá)及功能的影響。
方法:
1.以6-溴-2-萘甲酸為起始原料,通過適當(dāng)?shù)墓倌軋F轉(zhuǎn)化及Heck反應(yīng)來合成6-Styryl-naphthalene-2-amidrazone derivatives,采
4、用核磁共振氫譜(1H NMR)和高分辨質(zhì)譜(HR-MS)對其結(jié)構(gòu)進(jìn)行確證。
2.使用II型膠原酶消化分離提取大鼠關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞,將細(xì)胞分為正常組、溶劑DMSO組、化合物五個濃度組及陽性藥阿米洛利(Amiloride)組,觀察化合物對大鼠關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞生存率的影響;軟骨細(xì)胞被分為五組分別在pH7.4、pH7.0、pH6.5、pH6.0、pH5.5的培養(yǎng)基中孵育以及于胞外酸化(pH6.0)刺激0 min、30 min、1 h、3 h、
5、6 h、12 h,觀察兩者條件下對軟骨細(xì)胞中ASIC1a蛋白表達(dá)的影響,選取最適條件用于觀察化合物對軟骨細(xì)胞中ASIC1a表達(dá)的影響;使用激光掃描共聚焦顯微鏡觀察胞外酸化(pH6.0)刺激下化合物對軟骨細(xì)胞中[Ca2+]i水平的影響。
結(jié)果:
1.本實驗合成了8個新型化合物,分別為:
5a:6-Styryl-naphthalene-2-amidrazone;
5b:6-[2-(4-Fluoro-p
6、henyl)-vinyl]-naphthalene-2-amidrazone;
5c:6-[2-(4-Chloro-phenyl)-vinyl]-naphthalene-2-amidrazone;
5d:6-[2-(2-Fluoro-phenyl)-vinyl]-naphthalene-2-amidrazone;
5e:6-[2-(4-Methoxy-phenyl)-vinyl]-naphthalene-2
7、-amidrazone;
5f:6-[2-(3-Fluoro-phenyl)-vinyl]-naphthalene-2-amidrazone;
5g:6-[2-(3-Chloro-phenyl)-vinyl]-naphthalene-2-amidrazone;
5h:6-(2-p-Tolyl-vinyl)-naphthalene-2-amidrazone,1H NMR和HR-MS表明其結(jié)構(gòu)正確。
8、2. MTT結(jié)果表明,除化合物5 h外,與正常組相比,其余化合物對大鼠關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞生存率無顯著性差異;Western Blot結(jié)果表明,1)與正常組相比,pH6.0與pH5.5能顯著升高軟骨細(xì)胞中ASIC1a蛋白的表達(dá),二者之間無統(tǒng)計學(xué)差異,2) pH6.0刺激3 h之前ASIC1a蛋白表達(dá)逐漸升高,3 h之后逐漸降低,由此,選取pH6.0刺激3 h為后續(xù)實驗條件,3)與pH6.0+DMSO組相比,除化合物5b外,其余化合物均能顯著降低
9、軟骨細(xì)胞中ASIC1a蛋白的表達(dá);激光共聚焦結(jié)果表明,化合物5a(25μM)、5c(50μM)、5d(25μM)、5e(50μM)、5g(25μM)、5h(50μM)均能降低胞外酸化(pH6.0)刺激下軟骨細(xì)胞中[Ca2+]i水平,其抑制程度分別為33.37%、20.83%、52.07%、81.40%、59.51%、63.23%,大部分活性可能均優(yōu)于Amiloride(100μM,抑制程度:23.49%),其中以化合物5e或5g的效果最
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