酸敏感離子通道1a抑制劑的設(shè)計、合成以及活性篩選.pdf

1、酸敏感離子通道（Acid sensing ion channels, ASICs），屬于退化因子/上皮鈉通道（degenerin/epithelial sodium channel, DEG/ENaC）超家族中的一員，在酸性條件下能夠被H+活化，通道開放。到目前為止，在哺乳動物中至少有7個ASIC亞基（ASIC1a, ASIC1b, ASIC1b2, ASIC2a, ASIC2b, ASIC3, ASIC4）已被克隆及鑒定。局部組織酸化

2、可以激活A(yù)SICs，進(jìn)而導(dǎo)致疾病的發(fā)生，ASICs很可能在組織酸化相關(guān)疾病中發(fā)揮關(guān)鍵作用。越來越多的研究表明，在ASIC亞基中，ASIC1a在伴隨著局部組織酸化的疾病如腫瘤、炎癥、癲癇及腦缺血等發(fā)生發(fā)展過程中扮演者重要角色，阻斷ASIC1a具有一定程度的保護(hù)作用，而現(xiàn)在仍缺乏高效、選擇性強的小分子ASIC1a抑制劑。為此，本研究通過先合成可能具有抑制ASIC1a的化合物，再以大鼠關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞為研究對象，探討化合物對大鼠關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞中AS

3、IC1a蛋白表達(dá)及功能的影響。
　　目的：
　　合成ASIC1a抑制劑（6-Styryl-naphthalene-2-amidrazone derivatives）以及體外觀察其對大鼠關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞中ASIC1a表達(dá)及功能的影響。
　　方法：
　　1.以6-溴-2-萘甲酸為起始原料，通過適當(dāng)?shù)墓倌軋F轉(zhuǎn)化及Heck反應(yīng)來合成6-Styryl-naphthalene-2-amidrazone derivatives，采

4、用核磁共振氫譜（1H NMR）和高分辨質(zhì)譜（HR-MS）對其結(jié)構(gòu)進(jìn)行確證。
　　2.使用II型膠原酶消化分離提取大鼠關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞，將細(xì)胞分為正常組、溶劑DMSO組、化合物五個濃度組及陽性藥阿米洛利（Amiloride）組，觀察化合物對大鼠關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞生存率的影響；軟骨細(xì)胞被分為五組分別在pH7.4、pH7.0、pH6.5、pH6.0、pH5.5的培養(yǎng)基中孵育以及于胞外酸化（pH6.0）刺激0 min、30 min、1 h、3 h、

5、6 h、12 h，觀察兩者條件下對軟骨細(xì)胞中ASIC1a蛋白表達(dá)的影響，選取最適條件用于觀察化合物對軟骨細(xì)胞中ASIC1a表達(dá)的影響；使用激光掃描共聚焦顯微鏡觀察胞外酸化（pH6.0）刺激下化合物對軟骨細(xì)胞中[Ca2+]i水平的影響。
　　結(jié)果：
　　1.本實驗合成了8個新型化合物，分別為：
　　5a：6-Styryl-naphthalene-2-amidrazone；
　　5b：6-[2-(4-Fluoro-p

6、henyl)-vinyl]-naphthalene-2-amidrazone；
　　5c：6-[2-(4-Chloro-phenyl)-vinyl]-naphthalene-2-amidrazone；
　　5d：6-[2-(2-Fluoro-phenyl)-vinyl]-naphthalene-2-amidrazone；
　　5e：6-[2-(4-Methoxy-phenyl)-vinyl]-naphthalene-2

7、-amidrazone；
　　5f：6-[2-(3-Fluoro-phenyl)-vinyl]-naphthalene-2-amidrazone；
　　5g：6-[2-(3-Chloro-phenyl)-vinyl]-naphthalene-2-amidrazone；
　　5h：6-(2-p-Tolyl-vinyl)-naphthalene-2-amidrazone，1H NMR和HR-MS表明其結(jié)構(gòu)正確。
　　

8、2. MTT結(jié)果表明，除化合物5 h外，與正常組相比，其余化合物對大鼠關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞生存率無顯著性差異；Western Blot結(jié)果表明，1）與正常組相比，pH6.0與pH5.5能顯著升高軟骨細(xì)胞中ASIC1a蛋白的表達(dá)，二者之間無統(tǒng)計學(xué)差異，2） pH6.0刺激3 h之前ASIC1a蛋白表達(dá)逐漸升高，3 h之后逐漸降低，由此，選取pH6.0刺激3 h為后續(xù)實驗條件，3）與pH6.0+DMSO組相比，除化合物5b外，其余化合物均能顯著降低

9、軟骨細(xì)胞中ASIC1a蛋白的表達(dá)；激光共聚焦結(jié)果表明，化合物5a（25μM）、5c（50μM）、5d（25μM）、5e（50μM）、5g（25μM）、5h（50μM）均能降低胞外酸化（pH6.0）刺激下軟骨細(xì)胞中[Ca2+]i水平，其抑制程度分別為33.37%、20.83%、52.07%、81.40%、59.51%、63.23%，大部分活性可能均優(yōu)于Amiloride（100μM，抑制程度：23.49%），其中以化合物5e或5g的效果最