新型雌激素受體亞型ERα36在乳腺癌中作用的初步研究.pdf

1、乳腺癌是女性最為常見(jiàn)的惡性腫瘤之一。美國(guó)癌癥協(xié)會(huì)研究表明，美國(guó)每年新增乳腺癌病例約194280例，為女性發(fā)病率最高的惡性腫瘤，因乳腺癌死亡的病例達(dá)40610例，死亡率僅次于肺癌而居第二位。隨著我國(guó)經(jīng)濟(jì)社會(huì)的不斷發(fā)展，近來(lái)年我國(guó)乳腺癌發(fā)病率也呈現(xiàn)明顯上升趨勢(shì)，已位居女性惡性腫瘤發(fā)病率的首位。因此，如何有效對(duì)乳腺癌進(jìn)行三級(jí)預(yù)防，提高綜合治療的效果，降低發(fā)病率與死亡率，已成為腫瘤學(xué)當(dāng)前的研究重點(diǎn)之一。
　　 目前乳腺癌的綜合治療包括外

2、科手術(shù)切除，藥物治療以及局部放射治療等手段。其中以三苯氧胺和芳香化酶抑制劑為代表的內(nèi)分泌治療(Endocrine therapy)因其具有確切的療效和良好的耐受性，在乳腺癌的藥物治療中占有重要地位。而腫瘤組織中雌激素受體(Estrogen receptor,ER)的狀態(tài)被廣泛認(rèn)為是預(yù)測(cè)患者對(duì)內(nèi)分泌治療反應(yīng)性和預(yù)后的關(guān)鍵指標(biāo)之一。目前一般認(rèn)為，雌激素受體有兩個(gè)亞型，即ERα和ERβ。其中分子量為66kD的ERa(ERa66)首先于1986

3、午被克隆，屬配體活化的核轉(zhuǎn)錄因子，具有六個(gè)功能區(qū)(A-F)，構(gòu)成數(shù)個(gè)結(jié)構(gòu)域。其中N端的A/B區(qū)構(gòu)成轉(zhuǎn)錄活化結(jié)構(gòu)域AF-1，介導(dǎo)非配體依賴(lài)的轉(zhuǎn)錄活化功能。C區(qū)負(fù)責(zé)結(jié)合特定的DNA序列及形成受體二聚體，D區(qū)為鉸鏈區(qū)。C端的E/F區(qū)構(gòu)成另一個(gè)結(jié)構(gòu)域AF-2，為配體依賴(lài)的轉(zhuǎn)錄活化結(jié)構(gòu)域。
　　 近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，由于剪切異構(gòu)體（Splice variants）的存在，ERα尚有數(shù)個(gè)亞型。Wang等于2005年發(fā)現(xiàn)了一個(gè)分子量為36kD的新

4、型ERα亞型，命名為ERα36。與全長(zhǎng)ERα66相比，該亞型缺少轉(zhuǎn)錄活化結(jié)構(gòu)域AF-1及AF-2，但仍保留DNA結(jié)合域及部分二聚體形成域和配體結(jié)合域，并在C端具有一個(gè)由27個(gè)氨基酸所組成的新型結(jié)構(gòu)域。前期研究表明，ERα36在乳腺癌細(xì)胞系及乳腺癌組織中均有表達(dá)，且通過(guò)在人胚胎腎細(xì)胞系HEK293中的研究表明，由于缺乏內(nèi)在的轉(zhuǎn)錄活性，ERα36可競(jìng)爭(zhēng)性抑制ERα66所介導(dǎo)的受體依賴(lài)或非依賴(lài)的轉(zhuǎn)錄活化，但可介導(dǎo)MAPK/ERK信號(hào)通路的活化

5、。目前尚未有文獻(xiàn)系統(tǒng)報(bào)道ERα36在人乳腺癌發(fā)生發(fā)展中所起的作用。我們的前期工作表明，ERα36在結(jié)直腸癌中的表達(dá)低于臨近正常組織，在結(jié)直腸癌的發(fā)生發(fā)展中起一定的作用。為了研究ERα36與人乳腺癌的關(guān)系，本課題檢測(cè)了ERα36在74對(duì)乳腺癌及其相應(yīng)臨近正常乳腺組織中的表達(dá)水平；構(gòu)建了ERα36的真核表達(dá)載體，并在低表達(dá)ERα36的人乳腺癌細(xì)胞系MCF-7中得到穩(wěn)定表達(dá)；研究了ERα36轉(zhuǎn)染前后乳腺癌細(xì)胞系MCF-7對(duì)雌激素、三苯氧胺的反

6、應(yīng)性以及對(duì)化療藥物紫杉醇敏感性的差異。具體內(nèi)容如下：
　　 第一部分：ERα36和ERα66在乳腺癌及臨近正常乳腺組織中的表達(dá)。采用實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)，檢測(cè)ERα36和ERα66的mRNA在74對(duì)乳腺癌及其相應(yīng)臨近正常乳腺組織中表達(dá)的差異，分析其在乳腺癌發(fā)生過(guò)程中可能的作用。同時(shí)，結(jié)合上述病例的臨床病理資料，如年齡、絕經(jīng)狀態(tài)、腫瘤大小、淋巴結(jié)受累情況及腫瘤分期等，分析乳腺癌組織中ERα36和ERα66的表達(dá)與上述指標(biāo)之間的關(guān)系。

7、結(jié)果表明，乳腺癌組織中ERα36的表達(dá)水平顯著低于相應(yīng)臨近正常乳腺組織，且ERα36的低表達(dá)與較大的腫瘤直徑、淋巴結(jié)受累及較高的腫瘤分期有關(guān)，提示ERα36表達(dá)降低與乳腺癌的發(fā)生過(guò)程及進(jìn)展轉(zhuǎn)移過(guò)程密切相關(guān)。我國(guó)女性乳腺癌及臨近正常乳腺組織ERα66的表達(dá)規(guī)律與美國(guó)非洲裔女性乳腺癌相仿，提示二者具有共同的臨床特征，可按照相似的策略進(jìn)行內(nèi)分泌治療。
　　 第二部分：ERα36真核表達(dá)載體的構(gòu)建表達(dá)及其對(duì)人乳腺癌MCF-7細(xì)胞系生物學(xué)

8、行為的影響。本課題組的前期工作已克隆并鑒定了ERα36的全長(zhǎng)編碼序列并成功連接于真核表達(dá)載體pcDNA3.1(+)上，構(gòu)建出ERα36的真核表達(dá)載體pcDNA3.1(+)-ERα36。由于尚未有商業(yè)化的特異性ERα36抗體，給鑒定細(xì)胞內(nèi)的ERα36表達(dá)情況帶來(lái)了很大的困難，因此，本課題將FLAG標(biāo)簽肽編碼序列片段插入pcDNA3.1(+)-ERα36載體中，成功構(gòu)建pcDNA3.1(+)-FLAG-ERα36真核表達(dá)體系，并經(jīng)測(cè)序確認(rèn)。

9、將上述ERα36表達(dá)載體穩(wěn)定轉(zhuǎn)染人乳腺癌細(xì)胞系MCF-7，經(jīng)Westernblot鑒定該蛋白在MCF-7細(xì)胞中表達(dá)。應(yīng)用MTT法檢測(cè)轉(zhuǎn)染ERα36前后，人乳腺癌細(xì)胞系MCF-7對(duì)雌激素、三苯氧胺的反應(yīng)性以及對(duì)化療藥物紫杉醇敏感性的變化。結(jié)果表明，在雌激素的作用下，轉(zhuǎn)染ERα36的MCF-7細(xì)胞的增殖能力明顯高于轉(zhuǎn)染空載體的對(duì)照細(xì)胞，而在三苯氧胺的作用下，轉(zhuǎn)染ERα36的MCF-7細(xì)胞的增殖能力也明顯提高。通過(guò)對(duì)治療乳腺癌常用化療藥物紫杉