雌激素受體α抑制膀胱侵襲.pdf

1、膀胱癌是第二常見的泌尿生殖系統(tǒng)惡性腫瘤。隨著年齡的增長，男性和女性的發(fā)病率逐漸增加。男性發(fā)病率約為女性的三倍。在美國，2012年約50，000男性和17，000名女性患膀胱癌。對香煙及工作環(huán)境致癌物的過度暴露或泌尿系統(tǒng)感染可能引起男性高患病率。然而，即使在缺乏這些危險因素的情況下，與性別有關的發(fā)病率的差異依然存在。因此，男女患者間的性激素及其受體的差異可能是膀胱癌發(fā)生率性別差異的潛在因素，然而有關此方面的證據(jù)仍較少。本研究分為四個部分：

2、
　　 第一部分：雌激素受體α(ERα)抑制膀胱癌細胞侵襲。
　　 目的：探討ERα與膀胱癌細胞侵襲的關系。
　　 方法：首先穩(wěn)定轉染ERα或空載體質粒(vector)進入膀胱癌細胞。嘌呤霉素篩選5天后，免疫熒光測轉染效率。并收集蛋白，Western Blot進一步證實轉染效率。同時利用RNA干擾技術，選擇性的沉默人膀胱癌細胞株647v中ERα基因的表達。之后，使用3種ERα陰性膀胱癌細胞株（T24，UMUC3和

3、J82）和一種ERα陽性膀胱癌細胞株(647v)進行Transwell侵襲實驗。三維侵襲實驗進一步驗證這些膀胱癌細胞株的侵襲能力。
　　 結果：⑴成功建立了穩(wěn)定轉染ERα及shERα的膀胱癌細胞株。⑵采用Transwell系統(tǒng)研究ERα對膀胱癌細胞侵襲的影響。在T24細胞中過表達ERα，抑制癌細胞的侵襲。用另外兩個膀胱癌細胞株UMUC3和J82進行侵襲實驗也得到了類似的結果。另外，降低ERα在647v細胞的表達增加膀胱癌細胞的侵

4、襲。⑶相似的，采用三維侵襲實驗，證明在UMUC3細胞過表達ERα抑制或敲除647v細胞中ERα增強膀胱癌細胞的侵襲。
　　 結論：細胞侵襲實驗和三維侵襲實驗的結果顯示ERα抑制膀胱癌細胞的侵襲。
　　 第二部分：ERα敲除鼠模型建立及ERα抑制膀胱癌侵襲。
　　 目的：建立雌激素受體α基因敲除鼠(ERαKO)模型并體內研究ERα與膀胱癌侵襲的關系
　　 方法：建立ERαKO鼠需要兩代，我們首先交配ERαf

5、l/fl的雄性鼠與CMV-Cre轉基因雌性鼠，以獲得CMV-Cre/ERαfl/+鼠(F1)。再交配ERαfl/fl雄性鼠與 CMV-Cre/ERαfl/+雌性鼠(F1)，得到ERαfl/+(野生型，WT)和CMV-Cre/ERαfl/fl（ERαKO）鼠(F2)。自6周至18周，每日飲水中喂0.05％ N-丁基-N2（4-羥丁基）亞硝胺(BBN)以誘導膀胱癌發(fā)生。在28周（雄鼠）和38周（雌鼠）測血尿，30周（雄鼠）和40周（雌鼠）處

6、死鼠并取膀胱進行H&E染色以比較腫瘤的侵襲性。在30周（雄鼠）和40周（雌鼠）觀察小鼠的生存率。運用Kaplan-Meier生存曲線分析兩組間的生存率差異。
　　 結果：⑴通過交配ERαfl/fl雄性鼠與CMV-Cre/ERαfl/+雌性鼠成功建立ERαKO鼠，基因型分析證實該鼠內ERα基因缺失。⑵喂養(yǎng)0.05％BBN誘導WT鼠和ERαKO鼠發(fā)生膀胱癌。結果表明，相比WT鼠，ERαKO鼠有較嚴重的血尿。更重要的是，取膀胱組織進行

7、H&E染色的組織學檢查顯示，ERαKO小鼠與野生型小鼠相比，更多進展為肌層浸潤性腫瘤。⑶Kaplan-Meier生存曲線顯示，ERαKO小鼠生存率顯著低于野生型小鼠。
　　 結論：BBN誘導膀胱癌后，相比WT鼠，ERαKO鼠腫瘤具有較高侵襲性且預后較差。
　　 第三部分：ERα調節(jié)IGF1、MMP2表達抑制膀胱癌侵襲。
　　 目的：ERα抑制膀胱癌侵襲的機制研究。
　　 方法：①首先穩(wěn)定轉染ERα或vec

8、tor進入UMUC3膀胱癌細胞，應用qPCR檢測侵襲相關因子在兩組細胞中的表達差異。②應用T24，647v細胞進一步驗證篩選結果。③為研究篩選出的胰島素樣生長因子1(IGF1)，基質金屬蛋白酶2(MMP2)表達，10 ng/ml IGF1處理UMUC3 ERα/vector細胞8小時，Western Blot檢測MMP2蛋白表達，Transwell侵襲實驗研究細胞侵襲性。④50μM MMP2特異性抑制劑ARP-100處理647v shE

9、Rα細胞12小時，Transwell侵襲實驗研究細胞侵襲性。⑤免疫組化檢測WT鼠和ERαKO鼠腫瘤中ERα、IGF1和MMP2表達。
　　 結果：⑴qPCR檢測侵襲相關因子，轉染ERα進入UMUC3膀胱癌細胞降低IGF1和 MMP2表達。⑵在T24細胞中，過表達ERα降低IGF1和MMP2表達;647v細胞中，抑制ERα增強IGF1和MMP2表達。⑶IGF1處理UMUC3 ERα/vector細胞，MMP2表達增高。⑷IGF1處

10、理UMUC3 ERα細胞，逆轉ERα對膀胱癌細胞侵襲的抑制作用。⑸MMP2特異性抑制劑ARP-100處理647v shERα細胞，逆轉shERα對膀胱癌細胞侵襲的促進作用。⑹ERαKO鼠無ERα表達，且相比WT鼠，腫瘤中IGF1和MMP2表達增高。
　　 結論：ERα通過下調IGF1進而降低MMP2表達抑制膀胱癌的侵襲。
　　 第四部分：ERα激動劑體外和體內治療膀胱癌。
　　 目的：研究ERα激動劑在體外和體內

11、的治療效果。
　　 方法：①體外實驗，10％活性炭/葡聚糖處理的胎牛血清(CD-FBS)培養(yǎng)647v細胞3天，對照組DMSO處理，實驗組10 nM ERα激動劑丙基吡唑三醇(PPT)處理，24小時后進行Transwell侵襲實驗。②體內實驗，B6雌鼠(n=52)，自8周至20周，每日飲水中喂0.05％BBN誘導膀胱癌發(fā)生。52只小鼠隨機分為兩組，DMSO處理組及PPT治療組。自32周起，每兩日50μl的DMSO/PPT(210-

12、4M)腹腔注射。治療60天后處死小鼠并取膀胱組織，H&E染色以比較腫瘤的侵襲性。運用Kaplan-Meier生存曲線分析兩組間的生存率差異。
　　 結果：⑴相比于DMSO組，PPT處理后的647v細胞侵襲性減低。⑵體內實驗得到相同結果:H&E染色的組織學檢查顯示，DMSO處理組比PPT治療組鼠膀胱腫瘤更多進展為肌層浸潤性腫瘤。⑶Kaplan-Meier生存曲線顯示，PPT治療組小鼠生存率較好，但差異無統(tǒng)計學意義。