大白菜霜霉菌誘導(dǎo)抑制性消減cDNA文庫的構(gòu)建及防御相關(guān)基因的表達(dá)分析.pdf

1、大白菜[Brassica campestris L.ssp.Pekinensi（Lour.）Olsson]是我國栽培面積最大的蔬菜作物之一，并逐漸成為世界性蔬菜作物。大白菜霜霉病是由霜霉菌（Peronospora parasitica）引起的，從苗期到包心期或種株開花到結(jié)莢期均易發(fā)病，該病的發(fā)生會(huì)嚴(yán)重影響大白菜的產(chǎn)量及品質(zhì)，因此研究大白菜抗霜霉病機(jī)理對(duì)大白菜的育種工作具有重要意義。
　　 本研究以抗霜霉病大白菜為材料，構(gòu)建了霜霉

2、病誘導(dǎo)表達(dá)的正向抑制性消減文庫，研究了大白菜在霜霉病誘導(dǎo)下的差異表達(dá)基因；同時(shí)采用PCR技術(shù)克隆了5個(gè)防御基因的片段，通過應(yīng)用熒光定量的方法研究了它們?cè)谇秩舅咕蟮谋磉_(dá)情況，為進(jìn)一步揭示大白菜霜霉病抗性的分子機(jī)制及分子標(biāo)記輔助育種打下良好基礎(chǔ)。主要研究結(jié)果如下：
　　 1.以抗霜霉病DH系T12-19為材料，分別用接種大白菜霜霉病菌和噴蒸餾水0、6、12、24、48和72 h的雙鏈cDNA混合池作為Tester和Driver，

3、構(gòu)建正向消減cDNA文庫。經(jīng)藍(lán)白斑篩選，文庫的重組率為87.3％，獲得陽性克隆768個(gè)。文庫的插入片段分布在200-1000 bp，主要集中在200-500 bp。
　　 2.利用反向Northern斑點(diǎn)雜交技術(shù)對(duì)正向文庫的768個(gè)陽性克隆進(jìn)行了篩選，共荻得57個(gè)病原菌誘導(dǎo)上調(diào)表達(dá)的克??；測(cè)序后得到55條通讀EST；對(duì)這些EST序列進(jìn)行聚類和拼接分析，共獲得50個(gè)unigenes；經(jīng)BLAST比對(duì)結(jié)果表明，37個(gè)unigenes

4、與已知基因高度同源，占全部非重復(fù)序列的67.3％；對(duì)已知功能基因進(jìn)行功能分類，發(fā)現(xiàn)這些基因的功能主要涉及物質(zhì)與能量代謝、轉(zhuǎn)錄調(diào)控、蛋白質(zhì)合成與代謝、膜及轉(zhuǎn)運(yùn)、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、抗病防御等。此外，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)分析了文庫中3個(gè)克隆在霜霉菌誘導(dǎo)下的表達(dá)譜，結(jié)果表明，這3個(gè)克隆在接種病菌6 h后明顯上調(diào)表達(dá)，與反向Northern斑點(diǎn)雜交結(jié)果基本一致。
　　 3.采用PCR同源擴(kuò)增技術(shù)克隆了5個(gè)候選防御基因PR-1、PR-2（β-

5、1，3-glucanase）、PR-5（thaumatin like）、PAL和F日的cDNA片段。利用熒光定量PCR技術(shù)分析了這些防御基因在接種霜霉菌后的表達(dá)情況。結(jié)果表明，霜霉菌誘導(dǎo)后，2個(gè)編碼病程相關(guān)蛋白的基因BRPR1和BRPR5在接種霜霉菌12 h后明顯上調(diào)，而BRPR2在接種霜霉菌6 h后明顯上調(diào)，之后逐漸恢復(fù)到正常水平；編碼苯丙氨酸解氨酶的基因BRPAL在接種病菌6 h后明顯上調(diào)，12 h后下調(diào)表達(dá)；花青素早期合成相關(guān)基因