干出脅迫下孔石莼上調(diào)表達基因消減cDNA文庫的構(gòu)建與分析.pdf

1、為研究干出脅迫條件下孔石莼(Ulva pertusa)相關(guān)功能基因的差異表達情況，在實驗室內(nèi)模擬干出脅迫狀態(tài)，以處理后的孔石莼為檢測方(Tester)，以正常生長(對照組)的孔石莼為對照方(Driver)，利用抑制性消減雜交(Suppression subtractive hybridization，SSH)技術(shù)構(gòu)建了孔石莼在干出脅迫下上調(diào)表達基因的消減cDNA文庫。
　　 從孔石莼的消減cDNA文庫中隨機挑取160個克隆進行測

2、序，共得到可以利用的EST片段是150條，它們占到總測序樣品的93.8％。其中有21條為冗余序列(Redundantsequence，RS)，137條為非冗余序列(Non-redundant sequence，NRS)且全為獨立的EST片段(Singleton)。通過軟件分析和序列比對發(fā)現(xiàn)，片段長度都集中在100～900bp間，平均長度為364bp。根據(jù)這些ESTs推導(dǎo)出的多肽序列與已知功能蛋白的氨基酸序列的相似度主要集中在20％～60

3、％之間。其中，通過選取比對的22條EST序列發(fā)現(xiàn)，它們與已經(jīng)完成基因組測序的高等植物及藻類的氨基酸序列相比有較高的相似性。獲得的EST片段按其功能注釋主要分為以下幾大類：與細胞生長和發(fā)育相關(guān)，占22.63％；與蛋白合成及分解相關(guān)，占5.84％；與代謝相關(guān)，占7.30％；與脅迫應(yīng)答相關(guān)，占5.11％；與光合作用和光誘導(dǎo)相關(guān)，占5.11％；與轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)相關(guān)，占3.65％；與信號轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)，占6.57％；未知功能，占24.09％；無對比結(jié)果，占1

4、9.71％；未知功能和無對比結(jié)果的序列共60條，占非冗余序列的43.80％，比例較高。對22條EST序列的密碼子偏好性預(yù)測分析，計算結(jié)果顯示孔石莼對密碼子第三位各堿基的使用偏好無顯著差異(P>0.05)，GC使用總頻率為50.66％，在所分析的序列中，孔石莼終止密碼子明顯偏好 TGA。
　　 利用實時熒光定量PCR(Real-time fluorescence quantitative PCR，RTq-PCR)技術(shù)對八氫番茄紅素

5、脫氫酶紅素脫氫酶(Phytoene desaturase，PDS)、鈣調(diào)素(Calmodulin，CaM)、14-3-3蛋白(14-3-3-like protein，1433s)及滲透活化蛋白激酶(Osmotic stress-activatedprotein kinase，OSAK)在干出脅迫處理前后的表達量差別進行分析，結(jié)果顯示，這些基因表達量均隨處理時間的增加而呈上調(diào)趨勢。說明這些基因的表達調(diào)控在孔石莼抵御潮間帶干出脅迫的分子響應(yīng)