出血性中風(fēng)“瘀熱證”分子基礎(chǔ)及涼血通瘀方對(duì)其干預(yù)機(jī)制研究.pdf

1、出血性中風(fēng)病情危重，變化多端，是世界上第一位致殘?jiān)蚝偷诙恢滤涝?。探討出血性中風(fēng)急性期有效的治療方法對(duì)降低病死率、致殘率，提高治愈率至關(guān)重要。目前西醫(yī)內(nèi)科常規(guī)治療出血性中風(fēng)除脫水降低顱內(nèi)壓、預(yù)防應(yīng)激性消化道出血、控制感染等對(duì)癥治療外，尚無(wú)療效確切的新方法，運(yùn)用中醫(yī)藥防治出血性中風(fēng)急性期的報(bào)道較多，顯示出傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)的獨(dú)特優(yōu)勢(shì)。國(guó)醫(yī)大師-周仲瑛教授認(rèn)為“瘀熱阻竅”是出血性中風(fēng)急性期的基本病機(jī)，并確立了涼血通瘀為基本治療大法，該法融涼血、散

2、瘀、清熱、通腑、通絡(luò)、開(kāi)竅諸法于一爐，取得了良好的臨床效果。
　　 本論文是國(guó)家科技部973計(jì)劃——“‘瘀熱’病因在內(nèi)科難治病發(fā)病中的機(jī)制及其分子基礎(chǔ)研究”項(xiàng)目中的部分研究?jī)?nèi)容，旨在探討出血性中風(fēng)瘀熱證的分子基礎(chǔ)以及涼血通瘀方的干預(yù)機(jī)制。
　　 論文總體分為兩大部分：
　　 第一部分:文獻(xiàn)綜述
　　 對(duì)出血性中風(fēng)的一般情況，分子機(jī)制研究進(jìn)展，中醫(yī)藥治療現(xiàn)狀和涼血通瘀方及其活性成分的臨床與實(shí)驗(yàn)研究進(jìn)行了概述

3、。
　　 第二部分:實(shí)驗(yàn)研究
　　 研究目的：
　　 臨床試驗(yàn)部分通過(guò)分析比較出血性中風(fēng)瘀熱證與非瘀熱證患者檢測(cè)指標(biāo)的異同，揭示“瘀熱”復(fù)合病理因素的特質(zhì)；并通過(guò)比較對(duì)照組和試驗(yàn)組患者用藥前后凝血與炎癥相關(guān)指標(biāo)的變化，探索涼血通瘀法的療效機(jī)制；細(xì)胞實(shí)驗(yàn)通過(guò)建立血管內(nèi)皮細(xì)胞氧化損傷模型，探討涼血通瘀方含藥血清及其活性成分對(duì)過(guò)氧化氫(H2O2)誘導(dǎo)損傷的血管內(nèi)皮細(xì)胞的保護(hù)作用及作用機(jī)制，為臨床應(yīng)用提供客觀依據(jù)。

4、>　　 研究方法：
　　 1、臨床試驗(yàn)：運(yùn)用ELISA法檢測(cè)凝血相關(guān)指標(biāo)(凝血酶，纖溶酶PAF，SPECAM)和炎癥相關(guān)指標(biāo)(IL-1,4，6，8，10，13，TNF-a，HSP70，NF-KB)：試劑盒法檢測(cè)NO、NOS的表達(dá)，應(yīng)用中位數(shù)法(M±Q)統(tǒng)計(jì)分析瘀熱和非瘀熱患者之間，對(duì)照組和試驗(yàn)組治療前后、以及涼血通瘀方對(duì)瘀熱證患者治療前后的差異，揭示瘀熱證的本質(zhì)，探討涼血通瘀方療效機(jī)制；并通過(guò)基因芯片和實(shí)時(shí)定量PCR挖掘和驗(yàn)證

5、相關(guān)基因(MMP23B、DNAJB14、IL2RA、C1QTNF3、PDGFRB、F8、F2)和信號(hào)通路分子的表達(dá)情況，尋找作用靶點(diǎn)。
　　 2、藥物化學(xué)分析：通過(guò)HPLC和UHPLC-MS/MS檢測(cè)涼血通瘀方含藥血清中大黃素和大黃酸的濃度，確定大黃酸和大黃素為復(fù)方含藥血清中的有效活性成分。
　　 3、細(xì)胞實(shí)驗(yàn)：通過(guò)MTT法觀察涼血通瘀方含藥血清、有效活性成分不同劑量對(duì)細(xì)胞活性的影響，篩選出藥物的有效作用劑量；熒光分析術(shù)

6、、電鏡和流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)不同劑量藥物組的細(xì)胞凋亡情況；試劑盒法檢測(cè)各組SOD、MDA、NO和NOS的表達(dá)；Rt-PCR和Westemblot法檢測(cè)相關(guān)基因p53、p21和相關(guān)蛋白(NF-KB、Caspase3、P21、P53)的表達(dá)，探討涼血通瘀方對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞的保護(hù)作用及作用機(jī)制。
　　 研究結(jié)果:
　　 1、臨床試驗(yàn)結(jié)果：
　　 (1)、初步揭示了出血性中風(fēng)急性期瘀熱證的分子本質(zhì)，結(jié)果表明：瘀熱患者與非瘀熱患者

7、相比，血小板活化因子、IL-1、IL-4、IL-10、MMP9和NF-(K)B顯著升高；凝血酶活力、IL-6、TNF-a、HSP-70、HSP-27有升高的趨勢(shì)。基因芯片檢測(cè)結(jié)果顯示，瘀熱組與非瘀熱組比，多條炎癥與凝血相關(guān)因子編碼基因表達(dá)上調(diào)，差異表達(dá)的基因涉及到多條通路，其中主要是炎癥相關(guān)通路，也有部分凝血相關(guān)通路涉及血管生成、細(xì)胞凋亡、DNA損傷修復(fù)、免疫、細(xì)胞周期等信號(hào)通路。實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果表明TNFRSF18、CIQTNF

8、3、TNFAIP3、TNFRSF25、TRAFI、DNAJB14、HSF2等基因“瘀熱”患者表達(dá)顯著高于“非瘀熱”患者。
　　 (2)、探討了涼血通瘀方的藥效作用及作用機(jī)制，結(jié)果表明：該方能使瘀熱患者凝血酶水平有降低的趨勢(shì)；降低瘀熱患者HSP70和TAT水平；促進(jìn)瘀熱阻竅證患者血管內(nèi)皮NO的分泌；對(duì)多條基因有調(diào)控作用；能夠下調(diào)多個(gè)炎癥與凝血相關(guān)因子編碼基因的表達(dá)水平，對(duì)與p53、p21基因表達(dá)有影響，對(duì)細(xì)胞凋亡相關(guān)基因有影響，這

9、些基因涉及凝血、炎癥、免疫、細(xì)胞凋亡、細(xì)胞周期等多條信號(hào)通路，實(shí)時(shí)定量PCR驗(yàn)證表明經(jīng)涼血通瘀方聯(lián)合基礎(chǔ)療法治療后TNFRSF18、CIQTNF3、TNFAIP3、TRAF1、DNAJB14、HSF2等基因表達(dá)明顯降低了。
　　 2、藥物化學(xué)分析結(jié)果：
　　 HPLC和UHPLC-MS/MS檢測(cè)結(jié)果表明了復(fù)方含藥血清高、中、低劑量均含有一定的藥物成分，含有大黃素和大黃酸兩種有效活性成分，為后續(xù)實(shí)驗(yàn)的開(kāi)展提供了有力的理論和

10、實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　 3、細(xì)胞實(shí)驗(yàn)結(jié)果：
　　 涼血通瘀方對(duì)H2O2誘導(dǎo)損傷的血管內(nèi)皮細(xì)胞有一定的保護(hù)作用?？梢愿纳萍?xì)胞形態(tài)：促進(jìn)細(xì)胞增殖；抑制細(xì)胞凋亡；提升SOD和NOS的活力；提高血管內(nèi)皮細(xì)胞分泌NO的能力；其中中劑量組的藥物能顯著降低p53、p21基因和NF-KB、P53、caspase-3和P21蛋白的表達(dá)，減輕H2O2對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞的損傷。
　　 小于15uM的大黃素和小于lOuM的大黃酸可以拮抗H2O2對(duì)

11、血管內(nèi)皮細(xì)胞造成的損傷。促進(jìn)細(xì)胞增殖，并呈現(xiàn)一定的量效關(guān)系；提升SOD和NOS酶的活力；增加NO含量和降低MDA的生成，尤其是5.OuM劑量的大黃素和1.25uM的大黃酸作用效果明顯，結(jié)果表明該劑量藥物能抑制內(nèi)皮細(xì)胞發(fā)生凋亡，降低P53基因和NF-KB、P53、caspase-3、P21蛋白的表達(dá)，保護(hù)血管內(nèi)皮細(xì)胞免受損傷，維持其正常結(jié)構(gòu)和功能。
　　 結(jié)論：
　　 1、出血性中風(fēng)“瘀熱”患者在凝血系統(tǒng)的激活、腦水腫及炎

12、癥發(fā)生程度、炎癥和凝血相關(guān)基因和信號(hào)通路分子表達(dá)等方面與“非瘀熱”患者存在明顯差異，揭示了出血性中風(fēng)急性期“瘀熱阻竅證”的本質(zhì)與凝血、炎癥病理的相關(guān)性，因血行凝滯不暢導(dǎo)致“瘀”，機(jī)體炎性反應(yīng)導(dǎo)致“熱”是出血性中風(fēng)“瘀熱阻竅”證的本質(zhì)。
　　 2、涼血通瘀方影響出血性中風(fēng)患者凝血和炎癥相關(guān)指標(biāo)的表達(dá)，緩解血瘀，控制炎癥；降低瘀熱患者HSP70的表達(dá)，改善患者整體狀態(tài)，減輕機(jī)體損傷；增強(qiáng)NO分泌，舒張血管，改善病情；降低TAT水平，

13、減輕繼發(fā)性病理?yè)p害，改善ICH患者的預(yù)后；調(diào)控與凝血、炎癥、免疫和凋亡等有關(guān)的基因和信號(hào)通路，提高臨床治療效果。
　　 3、涼血通瘀方及其活性成分對(duì)H2O2誘導(dǎo)損傷的血管內(nèi)皮細(xì)胞有保護(hù)作用，其中中劑量（臨床等效量）作用效果好于高、低劑量組,5.0uM劑量的大黃素和1.25uM的大黃酸作用效果較為顯著，它們的作用機(jī)制主要與抑制內(nèi)皮細(xì)胞凋亡、抑制p53、p21等基因的表達(dá)，降低NF-(K)B、P53、caspase-3、P21蛋白的

14、表達(dá)有關(guān)，我們推測(cè)保護(hù)血管內(nèi)皮細(xì)胞是涼血通瘀方治療出血性中風(fēng)的可能途徑之一，而大黃酸和大黃素可能是涼血通瘀方發(fā)揮藥效的主要活性成分之一。
　　 本研究通過(guò)臨床和實(shí)驗(yàn)研究，以周仲瑛教授的“瘀熱”創(chuàng)新學(xué)說(shuō)為指導(dǎo)，進(jìn)行瘀熱相搏證本質(zhì)的探討，闡明涼血化瘀治法方藥的作用機(jī)理，實(shí)驗(yàn)對(duì)象包括臨床標(biāo)本和體外細(xì)胞株；實(shí)驗(yàn)用藥涉及復(fù)方和活性成分；實(shí)驗(yàn)選用細(xì)胞生物學(xué)、分子生物學(xué)技術(shù)，實(shí)驗(yàn)反證了“瘀熱”的分子基礎(chǔ)，驗(yàn)證了涼血通瘀方的現(xiàn)代機(jī)制，本研究具有