microRNA在胃癌細(xì)胞株MKN-45腫瘤干細(xì)胞中的表達(dá)譜研究.pdf

1、本文從以下幾部分進(jìn)行了論述。
　　第一部分 懸浮培養(yǎng)法分離人胃癌細(xì)胞株MKN-45腫瘤干細(xì)胞
　　目的:探討懸浮培養(yǎng)法在胃癌細(xì)胞株MKN-45中分離胃癌干細(xì)胞的可行性,為研究胃癌干細(xì)胞建立一種細(xì)胞模型。
　　方法:人胃癌細(xì)胞株MKN45購自中科院上海細(xì)胞庫。MKN45細(xì)胞復(fù)蘇以后在含10％胎牛血清(FBS)的RPMI-1640培養(yǎng)液中培養(yǎng),細(xì)胞貼壁以后,收集貼壁細(xì)胞置于含無血清的RPMI-1640培養(yǎng)液96孔超低粘附板

2、(Corning)中培養(yǎng),培養(yǎng)液中加入1％N-2添加劑,2％B-27添加劑(Invitrogen),1％青鏈霉素(Gibco),20ng/ml人FGF-2和100ng/mlEGF(Chemicon),觀察的腫瘤球形成情況,每孔100個(gè)細(xì)胞,兩周后在倒置顯微鏡(Olympus)下放大40及100倍觀察腫瘤球形成情況。當(dāng)形成的克隆球長到200-500個(gè)細(xì)胞時(shí),將腫瘤球溶解成1000個(gè)/ml細(xì)胞的溶液,按每孔100μL單細(xì)胞懸液植入含無血清培

3、養(yǎng)液的96孔的超低粘附板(Corning)中,兩周后觀察第二代腫瘤球就形成情況,貼壁細(xì)胞作為對(duì)照組觀察成球情況。重復(fù)上述步驟,亞代球體細(xì)胞體外傳代培養(yǎng)六代以上。
　　結(jié)果:胃癌MKN-45細(xì)胞在無血清培養(yǎng)基中能形成懸浮球狀體。懸浮培養(yǎng)7d即開始形成細(xì)胞球體,培養(yǎng)至14d球體基本形成,中心密度増高。培養(yǎng)21d左右球體完全形成,球體結(jié)構(gòu)飽滿,細(xì)胞排列致密,中心密度更高。第一代球體細(xì)胞吹散后在無血清培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng),能繼續(xù)形成細(xì)胞球體,

4、隨著傳代代數(shù)的增加,成球率逐漸增高,傳代至第六代時(shí),成球率達(dá)29.70％±6.21％,而原代細(xì)胞的成球率為3.30％±1.49％,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。
　　結(jié)論:采用懸浮培養(yǎng)法在胃癌細(xì)胞株MKN-45中分離出的懸浮球體細(xì)胞具有自我更新與增殖的CSC的特性。
　　第二部分 人胃癌細(xì)胞株MKN-45腫瘤干細(xì)胞的鑒定
　　目的:鑒定懸浮培養(yǎng)法分離的懸浮球體細(xì)胞的腫瘤干細(xì)胞的特性,為進(jìn)一步研究胃癌干細(xì)胞建立一種實(shí)

5、用而有效的細(xì)胞模型。
　　方法:①實(shí)時(shí)定量逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)檢測干性基因Oct-4,Nanog,Sox2以及CD44在球體細(xì)胞與貼壁細(xì)胞中的表達(dá);②免疫熒光檢測干細(xì)胞標(biāo)志物 Oct-4,Nanog,Sox2以及CD44在MKN-45懸浮球體細(xì)胞及貼壁細(xì)胞中的表達(dá);③免疫印跡分析測定干細(xì)胞標(biāo)志物Oct-4,Nanog,Sox2以及CD44在MKN-45懸浮球體細(xì)胞的中的表達(dá);④化療耐受實(shí)驗(yàn):提取培養(yǎng)至14天的MKN-45球體細(xì)胞接

6、種于96超孔板低粘附板中,每孔2×103/200ul;取MKN-45貼壁細(xì)胞,接種于普通的96孔板中,每孔2×103/200ul。分別在球體細(xì)胞及貼壁細(xì)胞加入傳統(tǒng)化療藥5-Fu及DDP檢測,PBS作為內(nèi)參。藥物濃度及作用方式為單藥5-Fu(50μg/ml,100μg/ml,200μg/ml),單藥 DDP(10μg/ml,20μg/ml,40μg/ml),5-Fu聯(lián)合DDP(50μg/ml+10μg/ml;100μg/m+20μg/ml

7、;200μg/ml+40μg/m),化療藥作用24及48小時(shí)后,分別加入MTT37?C孵化4h,更換150mlDMSO。細(xì)胞存活數(shù)根據(jù)OD450nm(Abs)吸光值評(píng)估。;⑤選用雄性無胸腺裸鼠6-8周年齡24只,分別提取培養(yǎng)至14天MKN-45懸浮球體細(xì)胞數(shù)1x104,2x104,2x105,2x106個(gè),提取相應(yīng)數(shù)量的貼壁細(xì)胞作為對(duì)照。球體細(xì)胞注射在右前背部皮下,原代貼壁細(xì)胞注射在左前背部皮下,每7-10天觀察腫瘤形成情況,直至8周處

8、死,腫瘤標(biāo)本固定在10％福爾馬林液中,作H&E病理檢查。
　　結(jié)果:①實(shí)時(shí)定量PCR與免疫印跡實(shí)驗(yàn)顯示,球體細(xì)胞Oct-4,Sox2,Nanog和CD44的相對(duì)表達(dá)量分別為2.92±0.44、4.49±0.20、2.34±0.22、1.18±0.04;原代貼壁細(xì)胞Oct-4,Sox2,Nanog和 CD44的相對(duì)表達(dá)量分別為1.02±0,06、1.00±0.06、1.00±0.00、1.00±0.05,球體細(xì)胞Oct-4,Sox2

9、,Nanog和CD44明顯高于原代貼壁細(xì)胞(P<0.05)②免疫熒光顯示Oct-4,Sox2以及 Nanog蛋白主要在細(xì)胞核周圍及細(xì)胞質(zhì)中陽性表達(dá),而CD44主要在細(xì)胞膜上表達(dá)。Oct-4/CD44,Sox2/CD44以及Nanog/CD44雙重染色提示胚胎蛋白Oct-4、Sox2以及Nanog均與CD44在同一球體細(xì)胞中表達(dá);③5-Fu及DDP作用24小時(shí)后,球體細(xì)胞呈現(xiàn)明顯的藥物抵抗能力,球體細(xì)胞的存活率明顯高于原代貼壁細(xì)胞,其中,

10、50μg/ml,100μg/ml及200μg/ml5-Fu作用后,球體細(xì)胞的存活率分別為原代貼壁細(xì)胞的1.3倍,1.4倍和1.7倍,10μg/ml,20μg/ml及40μg/ml DDP作用后,球體細(xì)胞的存活率分別為原代貼壁細(xì)胞的1.7倍,3.2倍和3.4倍。作用48小時(shí),無論是5-Fu還是DDP,球體細(xì)胞存活率無明顯增高,但當(dāng)5-Fu聯(lián)合DDP作用24小時(shí)后,球體細(xì)胞存活率分別為原代貼壁細(xì)胞的2.6,2.9以及2.7倍,作用48小時(shí)后

11、球體細(xì)胞存活率分別為原代貼壁細(xì)胞的5.1倍,4.8倍以及5.4倍。④MKN-45球體細(xì)胞2x104個(gè)細(xì)胞即能形成移植瘤,而原代貼壁細(xì)胞需要2x106個(gè)細(xì)胞才能形成移植瘤,球體細(xì)胞致瘤能力是原代貼壁細(xì)胞的100倍。且球體細(xì)胞形成的腫瘤比原代貼壁細(xì)胞形成的瘤體大。H&E檢查顯示球體細(xì)胞形成的腫瘤與原代貼壁細(xì)胞形成的瘤體的病理改變表現(xiàn)相似,主要是已分化的胃癌細(xì)胞。
　　結(jié)論:懸浮培養(yǎng)法分離的懸浮球體細(xì)胞具有的腫瘤干細(xì)胞的特性,這些特性包

12、括自我更新與增殖能力、對(duì)傳統(tǒng)化療藥物的耐受性、高致瘤能力、干性基因與蛋白的高表達(dá)等。該方法為胃癌干細(xì)胞的進(jìn)一步研究提供了一種實(shí)用而有效的細(xì)胞模型。另外,Oct4/CD44、Sox2/CD44、Nanog/CD44可能分別是胃癌CSC的一種表型。
　　第三部分 microRNA在人胃癌細(xì)胞株MKN-45腫瘤干細(xì)胞中的表達(dá)譜
　　目的:探討microRNA在胃癌細(xì)胞株MKN-45腫瘤干細(xì)胞中的表達(dá)譜,預(yù)測miRNA的靶基因,并分

13、析其在胃癌干細(xì)胞中的生物學(xué)功能。
　　方法:①采用懸浮培養(yǎng)法分離出球體細(xì)胞(胃癌干細(xì)胞);②基因芯片(Agilent’shuman miRNA microarray,version18.0)測定球體細(xì)胞(胃癌干細(xì)胞)與貼壁細(xì)胞間的miRNA的特性表達(dá)譜;③RT-PCR驗(yàn)證miR-29a-3p,miR-181a-5p,miR-21-5p,miR-16-5p,miR-27a-3p,miR-22-3p,let-7b-3p,miR-34a

14、-5p,miR-4270,和miR-483-5p這10個(gè)miRNA的表達(dá),所有驗(yàn)證均重復(fù)三次。④通過MiRanda, TargetScan以及Pictar三個(gè)在線數(shù)據(jù)庫對(duì)上述10個(gè)miRNA作生物信息學(xué)分析,預(yù)測miRNA的靶基因,并分析其在胃癌干細(xì)胞中的生物學(xué)功能。這三個(gè)在線數(shù)據(jù)庫的網(wǎng)址分別是:miRanda:http://microrna.sanger.ac.uk;TargetScan:http://www.targetscan.o

15、rg。PicTar: http://www.ncrna.org/KnowledgeBase/link-Database/mirna_target_database,
　　結(jié)果:①microRNA芯片檢測結(jié)果顯示,懸浮培養(yǎng)法培養(yǎng)胃癌細(xì)胞株MKN-45所形成的懸浮球體細(xì)胞與原代貼壁細(xì)胞之間有1887個(gè)microRNA的表達(dá)存在程度不等的差異,其中差異在兩倍以上的microRNA有182個(gè),絕大多數(shù)(173個(gè))microRNA在球體細(xì)胞

16、中表達(dá)下調(diào),少部分(9個(gè))表達(dá)上調(diào)。②qRT-PCR驗(yàn)證結(jié)果顯示,10個(gè)microRNA在球體細(xì)胞與原代貼壁細(xì)胞間的相對(duì)表達(dá)量存在明顯差異,其中,7個(gè)microRNA(miR-29a-3p,miR-181a-5p,miR-21-5p,miR-27a-3p,miR-22-3p,miR-4270以及miR-483-5p)的表達(dá)水平與芯片檢測結(jié)果一致,3個(gè)microRNA(miR-16-5p,,let-7b-3p,miR-34a-5p)的表達(dá)

17、水平與芯片檢測結(jié)果不一致,符合率70％③MiRanda,TargetScan以及Pictar三個(gè)在線數(shù)據(jù)庫的交集中,有384對(duì)miRNA:mRNA配對(duì)靶點(diǎn),其中miR-181a-5p,miR-27a-3p,miR-34a-5p,miR-21-5p,miR-22-3p,miR-4270,let-7b-3p,以及miR-29a-3p可以預(yù)測到靶基因,而miR-483-5p與 miR-16-5p未能預(yù)測到靶基因。④我們采用CytoScapeR

18、軟件對(duì)miRNA–mRNA靶基因之間的相互作用的網(wǎng)絡(luò)作了分析,結(jié)果顯示,每一個(gè)miRNA可以有數(shù)十個(gè)乃至上百個(gè)靶基因,許多靶基因可以是多個(gè)miRNA的潛在靶基因,即多個(gè)miRNA可以調(diào)控同一個(gè)靶基因,這些靶基因中的絕大多數(shù)與肌動(dòng)蛋白骨架、粘著斑、胞外基質(zhì)受體的交互作用以及腫瘤的信號(hào)通路有關(guān)。特別是許多靶基因與干細(xì)胞相關(guān)的一些重要的信號(hào)通路有關(guān),這些信號(hào)通路包括Notch、Wnt/β-catenin、MAPK、mTOR以及JAK-STAT