厄洛替尼聯(lián)合放射誘導(dǎo)人胃腫瘤MKN45細(xì)胞株凋亡效應(yīng)的實驗研究.pdf

1、目的：觀察厄洛替尼聯(lián)合放療對MKN45細(xì)胞的增殖抑制作用以及對細(xì)胞周期和凋亡的影響，了解厄洛替尼對放療的增敏作用。
　　 方法：
　　 1.MKN45細(xì)胞在37°、5％的CO2孵箱于含10％胎牛血清和1％雙抗（青霉素和鏈霉素）的DMEM培養(yǎng)基中，24小時后取對數(shù)生長期細(xì)胞用于實驗。
　　 2.甲基偶氮唑藍(lán)(MTT)法檢測.(1)不同濃度的厄洛替尼作用于MKN45細(xì)胞后24、48、72、96小時后的細(xì)胞生長情況。(

2、2)不同劑量照射MKN45細(xì)胞后72小時的細(xì)胞生長抑制率。(3)不同濃度厄洛替尼聯(lián)合放射線對MKN45細(xì)胞的生長抑制率。本研究所有實驗重復(fù)3次。
　　 3.倒置顯微鏡下觀察各組細(xì)胞的形態(tài)學(xué)變化。
　　 4.單細(xì)胞集落形成實驗觀察對照組、單純照射組、厄洛替尼單藥組、厄洛替尼＋照射組的克隆數(shù)。
　　 5.多靶單擊模型S=1-(1-e-D/D0)N，擬合存活曲線并計算D0、Dq值，計算放射增敏比。
　　 6.流

3、式細(xì)胞儀檢測MKN45細(xì)胞經(jīng)厄洛替尼及厄洛替尼聯(lián)合照射處理后細(xì)胞周期分布情況。
　　 7.流式細(xì)胞儀(FCM)檢測Annexin V-EGFP和PI染色的MKN45細(xì)胞的凋亡率。
　　 8.Western Blots法檢測MKN45細(xì)胞經(jīng)厄洛替尼及厄洛替尼聯(lián)合照射處理后Bax與Bcl-2的表達(dá)。
　　 9.統(tǒng)計分析所有計量資料的數(shù)據(jù)均以x士s表示，實驗數(shù)據(jù)采用SPSS11.5統(tǒng)計軟件處理。均數(shù)比較采用單因素方差分

4、析、LSD-t檢驗，相關(guān)分析采用析因設(shè)計方差分析，與對照組比較，P＜0.05為有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　 結(jié)果：
　　 1.厄洛替尼對MKN45細(xì)胞的作用（MTT法）
　　 厄洛替尼能明顯抑制MKN45細(xì)胞的生長，隨用藥時間的延長，抑制率明顯上升(P＜0.05)；隨用藥濃度的提高，抑制率逐漸升高(P＜0.05)。MKN45細(xì)胞的存活分?jǐn)?shù)SF值隨厄洛替尼藥物濃度的增加或作用時間的延長而減少(P＜0.001)。
　　

5、 2.放射線及厄洛替尼對MKN45細(xì)胞的作用(MTT法)給予2、4、6、8Gy的劑量照射后72小時，MKN45細(xì)胞的生長明顯受到抑制，并且隨著照射劑量的增大，抑制率也有增大的趨勢。當(dāng)厄洛替尼濃度為2.5、5、10、15μmol/L時，與放射線聯(lián)合的抑制作用大于單藥或單獨(dú)照射的作用，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)。
　　 3.厄洛替尼作用后細(xì)胞形態(tài)變化厄洛替尼及與放射聯(lián)合作用于MKN45細(xì)胞24小時后即有部分細(xì)胞皺縮，隨著藥物

6、濃度的增大和時間的延長，細(xì)胞表面可見突起小膜泡（凋亡小體）不斷地脫落于培養(yǎng)液中；48小時后細(xì)胞變小變圓，皺縮變形的細(xì)胞進(jìn)一步增多，細(xì)胞數(shù)目減少；72小時后細(xì)胞數(shù)目顯著減少，部分細(xì)胞胞膜破裂呈壞死狀，胞漿濃縮呈泡狀，核仁消失。
　　 4.厄洛替尼聯(lián)合放射線對MKN45細(xì)胞的作用（單細(xì)胞集落形成實驗）
　　 厄洛替尼(2μmol/L)+照射組(6Gy)及單純照射(6Gy)組單細(xì)胞集落形成率分別是(1.97士0.14)％、(5

7、.1士0.21)％，兩者有顯著差異(P＜0.05)，提示厄洛替尼聯(lián)合放療能明顯抑制MKN45細(xì)胞的克隆性增殖。應(yīng)用多靶單擊模型求得，經(jīng)厄洛替尼處理后D0值減低，Dq值變小，放射增敏比為1.54。提示厄洛替尼對MKN45細(xì)胞有放射增敏作用。
　　 5.厄洛替尼對細(xì)胞周期的影響經(jīng)厄洛替尼作用后，MKN45細(xì)胞周期中的G1/G0期比例明顯增多，隨著時間的延長S期比例減少，24、48小時各時間段之間的差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)，說

8、明厄洛替尼可使MKN45細(xì)胞相對放射敏感期細(xì)胞增多。MKN45細(xì)胞經(jīng)單純照射后，G2/M期比例明顯升高。厄洛替尼+單純照射組照射后G2/M期比例較對照組也升高，升高的程度與單純照射組相比較有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)，厄洛替尼EGFR抑制劑的檢查點(check-point)為G1期，而放射線為G2期，兩者聯(lián)合使用后使放射不敏感的S期腫瘤細(xì)胞的比例降低，放射較為敏感的G2/M期和G0/G1期細(xì)胞比例增加，可增加細(xì)胞對放射的敏感性。

9、　　 6.厄洛替尼對細(xì)胞凋亡的影響在照射后48小時，凋亡率分別為，對照組為（4.34±0.63）％、照射組為(11.10士1.45)％、厄洛替尼組＋照射組為(23.2士0.41)％，經(jīng)析因設(shè)計方差分析方法統(tǒng)計，各組間都有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。表明厄洛替尼聯(lián)合照射后凋亡率明顯增加，提示二者具有協(xié)同作用。
　　 7.厄洛替尼對Bcl-2、Bax蛋白表達(dá)但的影響（western blots法）
　　 根據(jù)western

10、 blots結(jié)果發(fā)現(xiàn)，Bax蛋白在對照組表達(dá)量較低，而Bcl-2恰恰相反，表達(dá)量較高。經(jīng)過厄洛替尼及照射作用后，出現(xiàn)Bcl-2蛋白表達(dá)量明顯減少，厄洛替尼+照射組減少最明顯；Bax蛋白表達(dá)相反，厄洛替尼+照射組增加最明顯。厄洛替尼可增強(qiáng)放射調(diào)解Bcl-2、Bax蛋白表達(dá)及Bcl-2/Bax比率的作用而在分子水平上抑制腫瘤生長。
　　 結(jié)論：厄洛替尼聯(lián)合放療對MKN45細(xì)胞有明顯抑制作用。厄洛替尼的檢查點(check-point)