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1、目的:1.采用RQ-TRAP和 TRAP-ELISA法檢測(cè)不同細(xì)胞端粒酶活性,證實(shí) RQ-TRAP法的優(yōu)越性,
2.研究比較干細(xì)胞樣腫瘤細(xì)胞與普通腫瘤細(xì)胞端粒長(zhǎng)度的差異,探討干細(xì)胞樣腫瘤細(xì)胞中端粒的調(diào)節(jié)機(jī)制,
3.研究比較干細(xì)胞樣腫瘤細(xì)胞與普通腫瘤細(xì)胞端粒酶活性的差異和hTERT基因mRNA及蛋白質(zhì)表達(dá)水平的差異。
方法:1.采用RQ-TRAP和TRAP-ELISA兩種方法同時(shí)檢測(cè)12(9個(gè)腫瘤細(xì)胞系和3個(gè)
2、正常細(xì)胞系)種細(xì)胞的端粒酶活性,并比較兩種方法的檢測(cè)結(jié)果,2.利用無(wú)血清懸浮培養(yǎng)的方法培養(yǎng)富集球狀生長(zhǎng)的干細(xì)胞樣腫瘤細(xì)胞(sphere forming cells-SFCs),采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞表面標(biāo)志物,比較干細(xì)胞樣腫瘤細(xì)胞比例的變化,用RT-PCR方法檢測(cè)、比較細(xì)胞的干性和分化標(biāo)記物 Oct-4、SOX-2、CK-18的表達(dá)狀態(tài),3.采用實(shí)時(shí)熒光定量 PCR(Q-PCR)的方法檢測(cè)干細(xì)胞樣腫瘤細(xì)胞和正常培養(yǎng)的腫瘤細(xì)胞的端粒長(zhǎng)度4
3、.采用TRAP-ELISA方法檢測(cè)干細(xì)胞樣腫瘤細(xì)胞和正常培養(yǎng)的腫瘤細(xì)胞的端粒酶活性5.以普通的RT-PCR方法檢測(cè)干細(xì)胞樣腫瘤細(xì)胞和正常培養(yǎng)的腫瘤細(xì)胞hTERT基因的mRNA的表達(dá)水平、以Western blot方法檢測(cè)其蛋白質(zhì)表達(dá)水平。
結(jié)果:1. RQ-TRAP方法能準(zhǔn)確特異地檢測(cè)系列稀釋的293T細(xì)胞蛋白提取液的端粒酶活性,靈敏度可達(dá)8個(gè)細(xì)胞,擴(kuò)增效率為99%。陰性對(duì)照組則未檢測(cè)到端粒酶活性。RQ-TRAP方法測(cè)得12個(gè)
4、細(xì)胞系中端粒酶的活性與TRAP-ELISA方法結(jié)果有相關(guān)性(R2=0.7625),
2.流式細(xì)胞術(shù)分析結(jié)果顯示無(wú)血清懸浮培養(yǎng)獲得較高比例的干細(xì)胞樣腫瘤細(xì)胞,并且比普通腫瘤細(xì)胞高表達(dá)干細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子Oct-4、SOX-2,低表達(dá)分化因子 CK-18(P<0.05),
3.通過(guò) Q-PCR方法檢測(cè)結(jié)果分析,人乳腺癌干細(xì)胞樣腫瘤細(xì)胞(MCF7-SFCs)端粒長(zhǎng)度(1.201±0.05212)長(zhǎng)于人乳腺癌 MCF7細(xì)胞(1.0
5、19±0.1005),人宮頸癌干細(xì)胞樣腫瘤細(xì)胞(HeLa-SFCs)的端粒長(zhǎng)度(1.602±0.1355)長(zhǎng)于人宮頸癌 Hela細(xì)胞(1.024±0.0977),經(jīng) t檢驗(yàn)分析p>0.05,乳腺癌干細(xì)胞樣腫瘤細(xì)胞和宮頸癌干細(xì)胞樣腫瘤細(xì)胞與腫瘤細(xì)胞間端粒長(zhǎng)度的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,
4.采用TRAP-ELISA法檢測(cè)端粒酶活性結(jié)果顯示:人乳腺癌 MCF7細(xì)胞系、人宮頸癌 Hela細(xì)胞系、人乳腺癌干細(xì)胞樣腫瘤細(xì)胞(MCF7-SFCs)
6、和人宮頸癌干細(xì)胞樣腫瘤細(xì)胞(HeLa-SFCs)端粒酶活性均陽(yáng)性。干細(xì)胞樣腫瘤細(xì)胞的相對(duì)端粒酶活性(RTA)明顯低于普通腫瘤細(xì)胞,經(jīng) t檢驗(yàn)分析p<0.05,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
5.干細(xì)胞樣腫瘤細(xì)胞(MCF7-SFCs和 Hela-SFCs細(xì)胞)hTERT mRNA表達(dá)低于普通腫瘤細(xì)胞(MCF7細(xì)胞和Hela細(xì)胞),經(jīng)t檢驗(yàn)分析P<0.05,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;干細(xì)胞樣腫瘤細(xì)胞的hTERT基因蛋白質(zhì)表達(dá)水平均低于普通腫瘤細(xì)胞表達(dá)
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