慢病毒介導(dǎo)的KIF5B-RET融合基因轉(zhuǎn)染BEAS-2B細(xì)胞株的初步研究.pdf

1、目的:肺癌目前仍是全球范圍內(nèi)引起癌癥死亡的主要原因，晚期肺癌治療以化療為主，但其療效已達(dá)到平臺(tái)，隨著肺癌分子生物學(xué)的發(fā)展以及相關(guān)檢測(cè)手段的完善，分子靶向治療NSCLC已經(jīng)成為近年來(lái)的熱點(diǎn)。其中EGFR突變通路研究最為深入，多個(gè)東西方大型臨床試驗(yàn)表明(EGFR-Tyrosine Kinase Inhibitor)EGFR-TKI對(duì)EGFR活化突變的肺癌患者療效良好。在肺癌發(fā)生過(guò)程中，除基因突變之外，基因易位重排或基因融合同樣起著重要的作用

2、。繼ALK、ROS融合基因之后，KIF5B-RET融合基因?yàn)樽钚掳l(fā)現(xiàn)的肺癌融合基因，相關(guān)基礎(chǔ)研究已經(jīng)證實(shí)KIF5B-RET融合基因具有促進(jìn)細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)染成瘤的能力。但目前無(wú)論KIF5B-RET融合基因的功能性研究還是藥物敏感性研究?jī)H限于小鼠細(xì)胞系，該融合基因在人類細(xì)胞中的致癌特性尚未得知。BEAS-2B細(xì)胞為正常人支氣管上皮細(xì)胞，是模擬肺癌體外模型較為理想的細(xì)胞系，可排除肺癌細(xì)胞其他原癌基因靶點(diǎn)激活的干擾，且目前未發(fā)現(xiàn)用該細(xì)胞來(lái)研究KI

3、F5B-RET融合基因的報(bào)道。本研究主要應(yīng)用慢病毒感染的手段構(gòu)建KIF5B-RET融合基因陽(yáng)性的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染BEAS-2B細(xì)胞株并初步探討KIF5B-RET融合基因?qū)EAS-2B細(xì)胞的抑制細(xì)胞凋亡的作用，為后續(xù)的KIF5B-RET功能研究和藥物敏感性研究提供載體平臺(tái)。
　　方法:以KIF5B-RET融合基因融合點(diǎn)附近的BamHI位點(diǎn)為界，利用分段PCR的方法先分別擴(kuò)增出KIF5B基因片段和RET基因片段，進(jìn)行電泳鑒定。各片段分別與p

4、EASY-Blunt Zero Cloning載體進(jìn)行連接后轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)菌DH5a，擴(kuò)菌后提取質(zhì)粒進(jìn)行酶切鑒定和直接測(cè)序鑒定。帶NheI、BamHI位點(diǎn)的KIF5B質(zhì)粒片段和帶BamHI、SalI位點(diǎn)的RET質(zhì)粒片段一起與pCDH-CMV-MCS慢病毒表達(dá)載體進(jìn)行連接后轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)菌DH5a，擴(kuò)菌后提取質(zhì)粒進(jìn)行酶切鑒定和直接測(cè)序鑒定。用pMDLg/pRRE、pRSV-REV、pMD2.G、KIF5B-RET-pCDH四質(zhì)粒系統(tǒng)共轉(zhuǎn)染29

5、3T細(xì)胞進(jìn)行KIF5B-RET慢病毒的包裝和生產(chǎn)，收集上清病毒液，感染處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的BEAS-2B細(xì)胞，感染72小時(shí)后提取細(xì)胞RNA和蛋白進(jìn)行RT-PCR和口Western blot分別檢測(cè)KIF5B-RET融合基因mRNA和蛋白表達(dá)水平。PI單染色法流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)轉(zhuǎn)染后BEAS-2B細(xì)胞凋亡。
　　結(jié)果:RET基因有variant2和variant4兩種形式，本研究分段PCR擴(kuò)增得到KIF5B片段、RET variant2片段

6、和variant4片段，電泳條帶位置與理論大小相符。pEasy-KIF5B、pEasy-RET V2、pEasy-RET V4質(zhì)粒酶切條帶位置與理論大小相符，測(cè)序鑒定結(jié)果和標(biāo)準(zhǔn)序列基本完全吻合。KIF5B-RET V2-pCDH、KIF5B-RETV4-pCDH慢病毒穿梭質(zhì)粒酶切條帶位置與理論大小相符，測(cè)序鑒定結(jié)果和標(biāo)準(zhǔn)序列基本完全吻合。pCDH-CMV-MCS-EGFP重組慢病毒載體轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞及BEAS-2B細(xì)胞48小時(shí)熒光蛋白

7、表達(dá)強(qiáng)，熒光亮度90％以上。RT-PCR檢測(cè)結(jié)果顯示KIF5B-RET-PCDH慢病毒轉(zhuǎn)染BEAS-2B細(xì)胞后KIF5B-RET融合基因mRNA表達(dá)明顯，Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示KIF5B-RETv2-PCDH慢病毒轉(zhuǎn)染BEAS-2B細(xì)胞后KIF5B-RET融合蛋白表達(dá)明顯。經(jīng)去血清處理12小時(shí)后，KIF5B-RET V2轉(zhuǎn)染BEAS-2B細(xì)胞發(fā)生凋亡的比例為5.49％、5.98％、5.6％，EGFP轉(zhuǎn)染BEAS-2B細(xì)胞發(fā)