植物多酚類化合物聯(lián)合阿霉素抑制MCF-7-ADM細(xì)胞的篩選及白藜蘆醇逆轉(zhuǎn)耐藥性作用研究.pdf

1、乳腺癌是一種嚴(yán)重影響婦女身心健康甚至威脅生命的常見病與多發(fā)病，而腫瘤的多藥耐藥(MultidrugResistance，MDR)與化療的毒副反應(yīng)是臨床上制約乳腺癌患者化療的療效從而影響生存與預(yù)后的兩個嚴(yán)重問題。研究腫瘤MDR安全有效的逆轉(zhuǎn)劑是腫瘤化療中亟待解決的問題，亦是目前腫瘤研究的難點及熱點領(lǐng)域。本研究從六種主要植物多酚類化合物中篩選出聯(lián)合阿霉素抑制人乳腺癌多藥耐藥MCF-7/ADM細(xì)胞作用較強的化合物；研究該化合物聯(lián)合阿霉素對MC

2、F-7/ADM細(xì)胞產(chǎn)生的具體效應(yīng)、增敏效果及增敏的可能原因；探討增敏的可能機制；最后通過建立荷耐藥移植瘤裸鼠模型來明確該化合物聯(lián)合阿霉素治療耐藥腫瘤細(xì)胞移植瘤的體內(nèi)效果。在篩選植物多酚類化合物中，我們率先嘗試應(yīng)用均勻設(shè)計的方法，大大縮短實驗周期，得到理想的篩選結(jié)果，證實均勻設(shè)計是多因素、多水平的試驗的良好處理方法。 研究目的: 本研究通過體內(nèi)外實驗探討植物多酚類化合物協(xié)同阿霉素抑制人乳腺癌多藥耐藥MCF-7/ADM細(xì)胞的

3、作用，為尋找逆轉(zhuǎn)腫瘤多藥耐藥性的新藥物提供實驗依據(jù)。 研究方法與結(jié)果:1.植物多酚類化合物聯(lián)合阿霉素抑制人乳腺癌多藥耐藥MCF-7/ADM細(xì)胞作用的篩選將六種植物多酚類化合物按配伍組設(shè)計，用MTT法初篩對MCF-7/ADM細(xì)胞具有抑制作用的植物多酚類化合物；再把初篩出的化合物和阿霉素經(jīng)均勻設(shè)計，篩出聯(lián)合阿霉素MCF-7/ADM細(xì)胞作用較強的化合物；最后用單細(xì)胞凝膠電泳(SCGE)檢測篩出的化合物聯(lián)合阿霉素對正常肝細(xì)胞的毒性作用。

4、 結(jié)果顯示：槲皮素、白藜蘆醇和阿魏酸對MCF-7/ADM細(xì)胞的10％抑制濃度(IC10)分別是7.41μmol/L、10.70μmol/L、12.30μmol/L，兒茶素、大豆苷元、芝麻素在128μmol/L濃度下均無作用(P>0.05)；均勻設(shè)計的結(jié)果表明聯(lián)合阿霉素(ADM)抑制MCF-7/ADM細(xì)胞的作用中，白藜蘆醇(Res)較槲皮素和阿魏酸明顯；SCGE試驗證明12μmol/L白藜蘆醇和10μmol/L阿霉素不論是單用還是

5、聯(lián)合應(yīng)用均不會對正常肝細(xì)胞不會造成DNA的損傷。 2.白藜蘆醇對人乳腺癌MCF-7/ADM細(xì)胞耐藥性逆轉(zhuǎn)的研究采用MTT法測MCF-7/ADM細(xì)胞的耐藥性及Res對MCF-7/S和MCF-7/ADM細(xì)胞的抑制作用；同時將ADM和Res聯(lián)合作用于MCF-7/ADM細(xì)胞，通過計算聯(lián)合作用后的抑制率IR％和半數(shù)抑制濃度IC50值，得出Q值和逆轉(zhuǎn)倍數(shù)，以判斷Res的抑瘤增效及逆轉(zhuǎn)作用；最后應(yīng)用熒光分光光度法檢測聯(lián)合用藥后MCF-7/AD

6、M細(xì)胞內(nèi)阿霉素濃度的變化。 結(jié)果表明：ADM對MCF-7/S細(xì)胞IC50值為0.39μmol/L；對MCF-7/ADM細(xì)胞IC50值為21.38μmol/L；MCF-7/ADM細(xì)胞的耐藥倍數(shù)為54.82倍；Res對MCF-7/S細(xì)胞IC10值為8.46μmol/L，Res對MCF-7/ADM細(xì)胞IC10值為11.39μmol/L，Res在兩種細(xì)胞之間無耐藥性(1.35倍)；從Res的抑瘤增效實驗可知Res與ADM在體外均有相加或

7、增強作用，絕大多數(shù)聯(lián)合用藥組的Q>1.15，表明二者的作用主要表現(xiàn)為協(xié)同作用；同時Res具有提高M(jìn)CF-7/ADM細(xì)胞對ADM的敏感性，其逆轉(zhuǎn)倍數(shù)隨著Res濃度的增高而增加(ADM聯(lián)合4μmol/LRes時逆轉(zhuǎn)倍數(shù)為1.950，聯(lián)合8μmol/LRes時逆轉(zhuǎn)倍數(shù)為2.178，聯(lián)合12μmol/LRes時逆轉(zhuǎn)倍數(shù)為2.355)；熒光分光光度法檢測結(jié)果提示：不論MCF-7/S細(xì)胞和MCF-7/ADM細(xì)胞，細(xì)胞內(nèi)ADM濃度均隨細(xì)胞外化療藥物A

8、DM濃度的增加而升高，且耐藥細(xì)胞MCF-7/ADM內(nèi)ADM的濃度明顯低于敏感細(xì)胞MCF-7/S內(nèi)ADM的濃度(P<0.01)。當(dāng)加入Res后，與對照組相比，耐藥細(xì)胞MCF-7/ADM內(nèi)ADM的濃度明顯升高(P<0.05)，且細(xì)胞內(nèi)ADM濃度均隨細(xì)胞外ADM濃度升高而升高。 3.白藜蘆醇增加人乳腺癌MCF-7/ADM細(xì)胞內(nèi)阿霉素濃度的機制探討通過RT-PCR方法檢測Res對MCF-7/ADM細(xì)胞mdr-1mRNA轉(zhuǎn)錄的影響，Wes

9、tem-blot方法檢測Res對MCF-7/ADM細(xì)胞mdr-1基因表達(dá)產(chǎn)物P-gp的影響，探討白藜蘆醇增加人乳腺癌MCF-7/ADM細(xì)胞內(nèi)阿霉素蓄積性的機制。 結(jié)果提示:聯(lián)合治療后MCF-7/ADM細(xì)胞mdr-1基因表達(dá)和mdr-1基因表達(dá)產(chǎn)物P-gp表達(dá)量均較空白組、阿霉素組和白藜蘆醇組低(P<0.05)。 4.白藜蘆醇聯(lián)合阿霉素對荷耐藥移植瘤裸鼠的抑瘤作用研究建立小鼠乳腺癌模型后，經(jīng)腹腔注射不同藥物后，測定小鼠體重

10、、腫瘤體積和腫瘤重量，算出抑瘤率；并觀察用藥后的毒副作用；最后通過HE染色進(jìn)行腫瘤組織形態(tài)學(xué)觀察。 實驗結(jié)果提示:用藥6W后，ADM+Res組移植瘤體積(1.203±0.338)cm3明顯小于其余各組，抑瘤率為50.58％，與單用ADM組(1.979±0.307)cm3相比有差異(P<0.05)；腫瘤重量的結(jié)果與瘤體結(jié)果類似；未觀察到用藥后的毒副作用；經(jīng)不同處理后，單獨注射Res組小鼠體重較生理鹽水組及ADM組有所增加(P<0.

11、05)，而ADM+Res組治療前后體重?zé)o差異(P>0.05)；HE結(jié)果顯示與其他組相比，ADM+Res組腫瘤組織中出現(xiàn)大片壞死區(qū)域。 結(jié)論: 1.Res聯(lián)合ADM對人乳腺癌MCF-7/ADM細(xì)胞具有抑制作用，且對正常組織基本無毒副作用； 2.Res能逆轉(zhuǎn)MCF-7/ADM細(xì)胞的多藥耐藥性，其原因與增加ADM藥物濃度有關(guān)； 3.Res可提高ADM在MCF-7/ADM細(xì)胞內(nèi)的蓄積的原因與下調(diào)MCF-7/ADM