縫隙連接在損傷血管修復(fù)中作用的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、研究背景： 血管損傷性疾病如動(dòng)脈粥樣硬化、高血壓及糖尿病血管并發(fā)癥的發(fā)病率正逐年升高，是僅次腫瘤的的第二大致死因素，嚴(yán)重威脅著人類的健康。機(jī)械、炎性等損傷因素?fù)p傷血管內(nèi)皮后可誘導(dǎo)炎性細(xì)胞浸入、血管平滑肌細(xì)胞增殖，最終導(dǎo)致粥樣硬化、斑塊破裂及血管再狹窄，是粥樣硬化斑塊形成的始動(dòng)因素，也是血管損傷后不良修復(fù)反應(yīng)的主要原因之一。內(nèi)皮細(xì)胞損傷后，在生長(zhǎng)因子、化學(xué)因子、切應(yīng)力刺激及炎性介質(zhì)等因素的作用下，血管平滑肌細(xì)胞由血管中層向內(nèi)膜遷移

2、、增殖、合成及分泌細(xì)胞外基質(zhì)等是血管不良修復(fù)、新生內(nèi)膜過度增生的病理生理學(xué)基礎(chǔ)，也是動(dòng)脈粥樣硬化、再狹窄等血管損傷性疾病發(fā)生、發(fā)展的重要環(huán)節(jié)。抑制血管平滑肌的遷移、增殖是防治血管損傷性疾病的重要措施之一。因此，探討血管平滑肌遷移、增殖的自身內(nèi)在機(jī)制，從而尋找抑制血管平滑肌細(xì)胞遷移、增殖的措施，將會(huì)為血管損傷性疾病的防治提供新的策略。 研究目的： 縫隙連接介導(dǎo)的細(xì)胞間直接通訊可能在血管損傷修復(fù)中具有重要作用。本研究擬觀察縫

3、隙連接在內(nèi)皮損傷修復(fù)、血管平滑肌細(xì)胞增殖及表型轉(zhuǎn)化中的作用，并觀察縫隙連接在血管損傷后新生內(nèi)膜過度增生中的作用。另外，通過建立血管內(nèi)皮細(xì)胞及平滑肌細(xì)胞雙層共培養(yǎng)模型以觀察縫隙連接在內(nèi)皮細(xì)胞與血管平滑肌細(xì)胞相互調(diào)節(jié)中的作用，并初步探討在內(nèi)皮細(xì)胞與血管平滑肌細(xì)胞相互調(diào)節(jié)的過程中通過縫隙連接傳遞的信號(hào)介質(zhì)及可能的機(jī)制，從而為尋找血管損傷性疾病的防治新策略提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 研究方法： 1.為了探討內(nèi)皮縫隙連接在介導(dǎo)細(xì)胞間通訊及在損

4、傷血管內(nèi)皮修復(fù)中的作用，本實(shí)驗(yàn)采用植塊法培養(yǎng)大鼠主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞，并用抗vWF免疫熒光染色及透射電鏡觀察來鑒定培養(yǎng)的大鼠主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞，AnnexinⅤ/PⅠ染色及流式細(xì)胞檢測(cè)技術(shù)來檢測(cè)內(nèi)皮細(xì)胞凋亡，用體外血管新生試劑盒分析內(nèi)皮細(xì)胞體外成管能力，細(xì)胞免疫熒光染色法檢測(cè)大鼠主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞縫隙連接蛋白37、40及47的表達(dá)，熒光漂白后恢復(fù)技術(shù)檢測(cè)縫隙連接介導(dǎo)的細(xì)胞間通訊。機(jī)械劃痕建立內(nèi)皮損傷模型，每24h攝像一次以定量分析內(nèi)皮損傷修復(fù)速度，并

5、觀察縫隙連接特異性阻斷劑18α-甘草次酸(18α-GA)對(duì)內(nèi)皮損傷后修復(fù)的影響。 2.為探討縫隙連接阻斷劑對(duì)大鼠血管平滑肌細(xì)胞增殖及表型轉(zhuǎn)化的影響，本實(shí)驗(yàn)采用貼塊法培養(yǎng)大鼠主動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞，采用抗SMα-actin免疫熒光染色鑒定平滑肌細(xì)胞，細(xì)胞免疫熒光染色法及westernblot檢測(cè)大鼠主動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞縫隙連接蛋白43的表達(dá)，熒光漂白后恢復(fù)技術(shù)檢測(cè)縫隙連接介導(dǎo)的細(xì)胞間通訊，四唑鹽比色法測(cè)定細(xì)胞增殖能力以及采用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)?/p>

6、反應(yīng)檢測(cè)平滑肌α-肌動(dòng)蛋白的表達(dá)，并觀察縫隙連接特異性阻斷劑觀察18α-GA對(duì)上述指標(biāo)的影響。 3.為了觀察縫隙連接在調(diào)節(jié)血管張力及在血管損傷修復(fù)中的作用，本實(shí)驗(yàn)取大鼠主動(dòng)脈制成血管環(huán)分別測(cè)量在18α-GA作用前后血管環(huán)對(duì)NE和Ach反應(yīng)性的變化，建立大鼠頸動(dòng)脈損傷模型，給予生胃酮3mg/kg/d腹腔注射，對(duì)照組給予生理鹽水腹腔注射(2ml/d)，14天后處死動(dòng)物，取目標(biāo)血管段，用HE及DAPI-伊文思藍(lán)染色觀察新生內(nèi)膜厚度，細(xì)

7、胞免疫熒光染色法及westernblot檢測(cè)靶血管縫隙連接蛋白43的表達(dá)。 4.為了探討鈣離子跨縫隙連接在內(nèi)皮細(xì)胞與平滑肌細(xì)胞間的傳遞及其意義，本實(shí)驗(yàn)采用前述的植塊法分別培養(yǎng)大鼠主動(dòng)脈內(nèi)皮及平滑肌細(xì)胞，建立內(nèi)皮細(xì)胞與平滑肌細(xì)胞雙層共培養(yǎng)模型，并用透射電鏡觀察兩種細(xì)胞在transwellinsert膜兩側(cè)生長(zhǎng)情況，然后3H-TdR摻入法觀察平滑肌細(xì)胞的增殖情況，將細(xì)胞負(fù)載Fluo-3后，在用ETA(10-5M)和/或ETB(10-

8、5M)受體阻斷劑處理一種細(xì)胞后用ET-1(10-7M)刺激另一種細(xì)胞在激光共聚焦顯微鏡測(cè)定未刺激細(xì)胞內(nèi)熒光強(qiáng)度變化，并觀察18α-GA及肝素對(duì)上述變化的影響。用RT-PCR測(cè)定在上述處理中刺激內(nèi)皮細(xì)胞后平滑肌細(xì)胞內(nèi)c-fos及c-junmRNA表達(dá)的變化。 主要結(jié)果： 1.內(nèi)皮縫隙連接在介導(dǎo)細(xì)胞間通訊及在損傷血管內(nèi)皮修復(fù)中的作用：成功培養(yǎng)了大鼠主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞，vWF免疫熒光染色陽性、透射電鏡觀察可見WP小體。在內(nèi)皮細(xì)胞中

9、縫隙連蛋白37、40及47中均有表達(dá)。熒光物質(zhì)能夠通過縫隙連接在相鄰細(xì)胞間進(jìn)行傳遞，孤立細(xì)胞熒光恢復(fù)率顯著低于相鄰細(xì)胞(5.7±0.63％vs.82.26±1.68％，P＜0.01)：而18α-GA能夠抑制縫隙連接介導(dǎo)的細(xì)胞間通訊，18α-GA組的熒光恢復(fù)率顯著低于對(duì)照組(33.58±1.73％vs.82.26±1.68％，P＜0.01)。18α-GA可抑制內(nèi)皮細(xì)胞的體外成管能力，與正常對(duì)照組相比有顯著性差異(4.12±0.41vs.2

10、.32±0.58，P＜0.01)。 2.縫隙連接阻斷劑對(duì)大鼠血管平滑肌細(xì)胞增殖及表型轉(zhuǎn)化的影響：成功培養(yǎng)了大鼠主動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞，SMα-actin免疫熒光染色陽性。大鼠血管平滑肌細(xì)胞體外培養(yǎng)3天后可表達(dá)縫隙連接蛋白43。熒光物質(zhì)能夠通過縫隙連接在相鄰細(xì)胞間進(jìn)行傳遞，孤立細(xì)胞熒光恢復(fù)率顯著低于相鄰細(xì)胞(7.3±0.58％vs.80.61±6.57％，P＜0.01)；而18α-GA能夠抑制縫隙連接介導(dǎo)的細(xì)胞間通訊，18α-GA組的熒

11、光恢復(fù)率顯著低于對(duì)照組(41.43±7.62％vs.80.61±6.57％，P＜0.05)。 3.縫隙連接在調(diào)節(jié)血管張力及在血管損傷修復(fù)中的作用：?jiǎn)渭兘o予18α-GA處理血管環(huán)并未出現(xiàn)明顯的收縮或舒張反應(yīng)。在對(duì)照組中，給予去甲腎上腺素或乙酰膽堿后，血管環(huán)發(fā)生明顯的收縮或舒張反應(yīng)，而經(jīng)18α-GA預(yù)處理后，去甲腎上腺素或乙酰膽堿引起的血管環(huán)收縮或舒張反應(yīng)幅度顯著降低(NE:0.60±0.03vs.0.21±0.04；Ach:0.1

12、5±0.01vs.0.62±0.03；P＜0.05)。損傷2周生胃酮干預(yù)組血管血管新生內(nèi)膜明顯減輕，血管腔狹窄較單純損傷組輕。用新生內(nèi)膜細(xì)胞核計(jì)數(shù)的方法評(píng)價(jià)新生內(nèi)膜形成情況顯示，生胃酮干預(yù)組新生內(nèi)膜細(xì)胞核數(shù)量顯著低于對(duì)照組(89±28.40vs.236±15.04，n=5，P＜0.01)。在球囊損傷后2周后血管組織切片免疫熒光染色發(fā)現(xiàn)，在形成的新生內(nèi)膜中免疫熒光染色發(fā)現(xiàn)縫隙連接蛋白Cx43表達(dá)豐富。Westernblot結(jié)果顯示，對(duì)照組

13、縫隙連接蛋白Cx43的表達(dá)顯著高于生胃酮干預(yù)組(0.93±0.06vs.0.38±0.11，n=3，P＜0.01)。 4.鈣離子跨縫隙連接在內(nèi)皮細(xì)胞與平滑肌細(xì)胞間的傳遞：在共培養(yǎng)后第一天，EC/SMC組及SMC/SMC組平滑肌細(xì)胞3H-TdR摻入相比并無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(10900±1320cpm/well10430±1200，P＞0.05)。第二天，EC/SMC組平滑肌細(xì)胞3H-TdR的摻入就明顯小于SMC/SMC組(17200±1

14、734cpm/wellvs.20900±1659cpm/well)，兩者差異未達(dá)到統(tǒng)計(jì)學(xué)標(biāo)準(zhǔn)。到第三天這種差異更加明顯，EC/SMC組平滑肌細(xì)胞3H-TdR的摻入為25800±1984cpm/well，SMC/SMC組的則為33070±3569cpm/well，兩者相比有顯著性差異(P＜0.05)。在用18α-GA預(yù)處理24h后，EC/SMC共培養(yǎng)第三天后平滑肌細(xì)胞3H-TdR的摻入為明顯高于未處理EC/SMC組，兩者相比有顯著性差異(

15、30500±2650cpm/wellvs.25800±1984cpm/well，P＜0.05)。在內(nèi)皮細(xì)胞與平滑肌細(xì)胞雙層共培養(yǎng)體系中，用ET-1刺激上層的內(nèi)皮細(xì)胞，下層平滑肌細(xì)胞內(nèi)游離鈣濃度顯著升高，與加藥前相比有顯著差異。加入18α-GA以阻斷雙層細(xì)胞間的肌內(nèi)皮連接后，可抑制平滑肌細(xì)胞內(nèi)游離鈣濃度的升高(P＜0.01)。而用肝素處理平滑肌細(xì)胞則對(duì)細(xì)胞內(nèi)游離鈣濃度無顯著影響(P＞0.05)。用ET-1刺激平滑肌細(xì)胞，下層內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)游離

16、鈣濃度顯著升高，與加藥前相比有顯著差異。加入18α-GA以阻斷雙層細(xì)胞間的肌內(nèi)皮連接后，可抑制平滑肌細(xì)胞內(nèi)游離鈣濃度的升高(P＜0.01)。用肝素處理內(nèi)皮細(xì)胞后可抑制細(xì)胞內(nèi)游離鈣濃度升高的幅度，但不能完全阻斷其升高。在刺激內(nèi)皮細(xì)胞后，平滑肌細(xì)胞內(nèi)c-fos及c-junmRNA表達(dá)顯著增加，與未刺激內(nèi)皮細(xì)胞相比有顯著性差異(c-fos:0.957±0.051vs.0.682±0.038；c-jun:0.816±0.054.vs.0.467

17、±0.032；P＜0.01)。 全文結(jié)論： 1.內(nèi)皮細(xì)胞間存在縫隙連接介導(dǎo)的細(xì)胞間通訊，而這種通訊能夠調(diào)節(jié)內(nèi)皮損傷后的修復(fù)過程。 2.縫隙連接介導(dǎo)的細(xì)胞間直接通訊能夠調(diào)節(jié)平滑肌細(xì)胞的增殖能力以及平滑肌細(xì)胞由合成型向收縮型的轉(zhuǎn)化。 3.縫隙連接在生理?xiàng)l件下參與維持及調(diào)節(jié)血管張力，在病理?xiàng)l件能夠促進(jìn)血管損傷后新生內(nèi)膜的過度增生，在血管損傷性疾病的發(fā)生、發(fā)展過程中具有重要作用。 4.鈣離子能跨縫隙連接在