縫隙連接蛋白40與肺血管通透性的相關性研究.pdf

1、目的：觀察縫隙連接蛋白40（connexin40，Cx40）以及參與維持血管屏障完整性的血管內皮細胞鈣黏蛋白（ vascular endothelial cadherin， VE-cadherin）在C57BL/6小鼠急性肺損傷模型不同時期的表達變化情況，并探究Cx40與肺血管通透性的功能相關性。
　　方法：C57BL/6小鼠腹腔注射內毒素脂多糖（lipopolysaccharide,LPS）,以腹腔注射生理鹽水為對照組，24小時

2、后，分別行離體肺灌注，平穩(wěn)灌注后將左心房壓提高10cmH2O，檢測其肺重量變化情況以確保內毒素引起急性肺損傷模型的可靠性，進而采用蛋白免疫印跡的方法檢測腹腔注射LPS后6小時、24小時、3天后Cx40和VE-cadherin蛋白表達情況，以未處理組為空白對照；為研究Cx40與肺血管通透性的功能相關性，在C57BL/6小鼠離體肺灌注系統(tǒng)中使用血小板激活因子（platelet-activating factor，PAF）建立急性肺水腫模型，

3、運用Cx40特異抑制模擬肽gap2740以及非選擇性縫隙連接抑制劑甘珀酸（carbenoxolone）進行干預，通過離體肺灌注系統(tǒng)檢測gap2740以及甘珀酸對PAF效果的影響，初步確定Cx40與肺血管通透性的功能相關性；使用凝血酶（thrombin）處理人肺血管內皮細胞建立內皮細胞屏障功能破壞（即通透性增高）模型作為對照，運用甘珀酸進行干預，經ECIS(Electric Cell-Substrate Impedance Sensing

4、)檢測縫隙連接與肺血管內皮細胞通透性的關系；為進一步探究敲除Cx40基因對肺血管通透性的影響，通過離體肺灌注系統(tǒng)觀察PAF對Cx40基因敲除C57BL/6小鼠的影響，記錄肺重量變化情況，以使用PAF處理正常C57BL/6小鼠為對照
　　結果：腔注射LPS24小時后其肺重量升高的程度明顯高于生理鹽水對照組，腹腔注射LPS可有效建立急性肺損傷模型，蛋白免疫印跡檢測發(fā)現，Cx40蛋白表達在腹腔注射LPS6小時后明顯低于空白對照組，至24

5、小時其蛋白表達水平繼續(xù)降低，第3天Cx40蛋白表達相較于第24小時的表達有所回升， VE-cadherin的蛋白表達水平變化與Cx40一致；C57BL/6小鼠離體肺灌注實驗中，PAF在短時間內就可以引起肺重量急劇升高，導致強烈的肺水腫，而gap2740和甘珀酸均可以顯著緩解PAF致肺水腫效應，gap2740和甘珀酸的作用相當；經ECIS檢測發(fā)現，凝血酶可以明顯降低人肺血管內皮細胞的電阻抗，提示人肺血管內皮細胞通透性增加，而甘珀酸可以顯著

6、緩解凝血酶的作用；在Cx40基因敲除C57BL/6小鼠離體肺灌注實驗中，相較于正常C57BL/6小鼠，PAF引起Cx40基因敲除C57BL/6小鼠發(fā)生急性肺水腫的作用明顯降低。
　　結論：在內毒素引起的相對慢性肺損傷過程中， Cx40與VE-cadherin表達水平逐漸降低，并伴隨著血管通透性的增高；兩者表達水平在損傷和修復階段不斷發(fā)生變化，其變化情況一致。而在PAF以及凝血酶引起的相對急性肺損傷過程中，抑制Cx40以及縫隙連接可