縫隙連接在長QT綜合征室性心律失常發(fā)生中的作用及其機(jī)制研究.pdf

1、長QT綜合征(Long QT Syndrome, LQTS)是一種先天遺傳性，或者后天獲得的心臟復(fù)極延遲的疾病。長QT綜合征表現(xiàn)為心電圖上QT間期延長，它可以引起室性早搏及尖端扭轉(zhuǎn)性室速(Torsade de Pointes，TdP)等致命性的心律失常，心源性暈厥和猝死為長QT綜合征常見并發(fā)癥。長QT綜合征患者心電圖上QT間期異常延長，臨床上長QT綜合征患者反復(fù)發(fā)生心源性暈厥、并常導(dǎo)致猝死的發(fā)生。
　　 近年來許多研究表明，除了

2、心臟復(fù)極時程的延長以外，跨室壁復(fù)極離散度（transmurAldispersion of repolarization，TDR）的增加在長QT綜合征早期后除極（early afterdepolarization，EAD）的產(chǎn)生，以及心律失常TdP的誘發(fā)和維持中也起著重要作用。長QT綜合征中增大的TDR可使得EAD能夠跨室壁傳導(dǎo)，EAD跨室壁傳導(dǎo)導(dǎo)致心臟的觸發(fā)活動（比如R-on-T期前收縮）和致命性的心律失常TdP的產(chǎn)生。長QT綜合征TD

3、R的增加同時也可以通過二相折返的機(jī)制來維持TdP的發(fā)生。心臟各層心肌細(xì)胞有著顯著的電生理特性和功能上的差異，近年來一些研究表明心室壁各層心肌細(xì)胞表面離子通道表達(dá)和功能的差異，使得跨室壁復(fù)極離散度異常增加。
　　 心臟各層心肌細(xì)胞有著顯著的電生理特性和功能上的差異導(dǎo)致了跨室壁復(fù)極離散度的形成，而心肌細(xì)胞間之間通過縫隙連接耦連。心肌細(xì)胞的縫隙連接位于閏盤處，動作電位通過縫隙連接從一個細(xì)胞擴(kuò)布到相鄰的細(xì)胞?？缒るx子及小分子物質(zhì)可通過心

4、肌細(xì)胞的縫隙連接直接交換, 心肌細(xì)胞的縫隙連接在維持正常的心臟節(jié)律和細(xì)胞間的代謝物交換方面扮演著重要角色。由于整體心臟中心肌細(xì)胞間存在縫隙連接，小分子物質(zhì)通過縫隙連接順著電化學(xué)梯度在心肌細(xì)胞間傳遞，從而減少了心肌細(xì)胞間的電生理異質(zhì)性。在整體心臟中，由于心肌細(xì)胞間良好的縫隙連接耦連，使得跨室壁復(fù)極的差異小于單個心肌細(xì)胞間動作電位時程的差異。近來有研究結(jié)果顯示，在正常和心衰的心臟中，縫隙連接蛋白Cx43的表達(dá)、分布和磷酸化均影響了跨室壁復(fù)極

5、的異質(zhì)性?？p隙連接蛋白磷酸化狀態(tài)的改變可影響縫隙連接通道的開放和代謝，造成縫隙連接的解耦連和功能下降。Carbenoxolone（縫隙連接解耦連劑）可增加復(fù)極離散度，而增加各層心肌細(xì)胞間縫隙連接的耦連，可減少跨室壁復(fù)極時程的差異?？p隙連接耦連增強(qiáng)劑抗心律失常肽AAP10和HP-5能夠增加縫隙連接功能，進(jìn)而減少動作電位時程的離散度。增加心肌細(xì)胞間縫隙連接的耦連，可以防止病理狀態(tài)跨室壁復(fù)極離散度的異常增加。
　　 心肌肥厚和心衰等多

6、種心臟疾病的跨室壁復(fù)極離散度增加，同時其伴有心肌細(xì)胞間縫隙連接失耦連。這些研究結(jié)果表明改變心肌細(xì)胞間縫隙連接耦連，可能影響心臟各層心肌細(xì)胞間復(fù)極特性的差異的大小。因而我們推測增加心臟心肌細(xì)胞間縫隙連接的耦連，可以減少跨室壁復(fù)極離散度，進(jìn)而預(yù)防長QT綜合征室性心律失常的發(fā)生。本研究檢測了縫隙連接激動劑抗心律失常肽(AAP10)對兔LQT3和犬LQT2模型跨室壁復(fù)極離散度和室性心律失常的影響并探討其作用機(jī)制。
　　 第一部分抗心律失

7、常肽對兔LQT3模型縫隙連接耦連和室性心律失常的影響
　　 目的：跨室壁復(fù)極離散度（transmurAldispersion of repolarization，TDR）的增加可導(dǎo)致長QT綜合征心律失常的發(fā)生。 心肌細(xì)胞的縫隙連接也參與了跨室壁復(fù)極離散度的形成和維持。本實(shí)驗研究了縫隙連接激動劑抗心律失常肽(AAP10)，對兔LQT3模型縫隙連接磷酸化，以及室性心律失常的影響并探討其作用機(jī)制。
　　 方法：心肌細(xì)胞鈉通道開

8、放劑?？舅谹TX-II (20Nm, Calbiochem Corp., La Jolla, CA, USA)和兔左室楔型心肌塊用于建立LQT3模型?？剐穆墒Сｋ腁AP10(縫隙連接激動劑，Chinese Peptide Co., Hangzhou, Zhejiang, China) 用于增加心肌細(xì)胞間縫隙連接耦連。采用浮置玻璃微電極法，同步記錄心外膜、心內(nèi)膜心肌細(xì)胞跨膜動作電位，同時記錄跨室壁心電圖。免疫印跡法（Western bl

9、ot）檢測心肌細(xì)胞縫隙連接蛋白43 (Connexin43， Cx43)去磷酸化水平的變化。
　　 基礎(chǔ)步長1000ms起搏1小時（電生理穩(wěn)定），藥物均溶解于臺氏液，通過左室楔型心肌組織塊冠狀動脈插管灌流。左室楔型心肌組織塊隨機(jī)分為正常組、LQT3組、AAP-100nM和AAP-500nM干預(yù)組：正常組灌流正常臺式液（n=10）、LQT3組灌流含20Nm ATX-II的臺式液（n=10）、AAP-100nM干預(yù)組灌流含20Nm

10、ATX-II和100Nm AAP10的臺式液（n=10）、AAP-500nM干預(yù)組灌流含20Nm ATX-II和500Nm AAP10的臺式液（n=10）。
　　 在基礎(chǔ)狀態(tài)下、AAP10預(yù)處理時和灌流ATX-II的LQT3階段，觀察并記錄左室楔型心肌組織塊自發(fā)性心律失常，以及程序刺激誘發(fā)的左室楔型心肌組織塊心律失常。QT間期為起搏信號到T波下降支與基線交叉點(diǎn)間的距離；動作電位復(fù)極90％時程(APD90)為動作電位0期到復(fù)極至9

11、0％振幅的時程；跨室壁復(fù)極離散度（TDR）為同一心搏心內(nèi)膜和心外膜復(fù)極時間差值。
　　 結(jié)論：縫隙連接激動劑AAP10防止Cx43去磷酸化，減少了兔LQT3模型的跨室壁復(fù)極離散度和心律失常發(fā)生率，說明兔LQT3模型的縫隙連接可能參與了跨室壁復(fù)極離散度的形成。
　　 第二部分抗心律失常肽對犬LQT2模型縫隙連接重構(gòu)和室性心律失常的影響
　　 目的：跨室壁復(fù)極離散度（transmurAldispersion of r

12、epolarization，TDR）的增加可導(dǎo)致長QT綜合征心律失常的發(fā)生。 心肌細(xì)胞的縫隙連接也參與了跨室壁復(fù)極離散度的形成和維持。本實(shí)驗研究了縫隙連接激動劑抗心律失常肽(AAP10)，對犬LQT2模型縫隙連接磷酸化，以及室性心律失常的影響并探討其作用機(jī)制。
　　 方法：應(yīng)用心肌細(xì)胞Ikr通道阻斷劑d-sotalol (100Μm, Sigma, St. Louis, MO, USA)在犬左室楔型心肌塊建立LQT2模型?？剐穆?/p>

13、失常肽AAP10(縫隙連接激動劑，Chinese Peptide Co., Hangzhou, Zhejiang, China) 用于增加心肌細(xì)胞間縫隙連接耦連。采用浮置玻璃微電極法同步記錄心內(nèi)膜、中層（M細(xì)胞）和心外膜心肌細(xì)胞跨膜動作電位及跨室壁心電圖。免疫印跡法（Western blot）檢測心肌細(xì)胞縫隙連接蛋白43 (Connexin43， Cx43)總的Cx43和去磷酸化Cx43水平的變化。應(yīng)用熒光免疫組化技術(shù)檢測上述各組心肌細(xì)

14、胞縫隙連接蛋白Cx43表達(dá)、空間分布和磷酸化水平的改變。
　　 基礎(chǔ)步長1000ms起搏1小時（電生理穩(wěn)定），藥物均溶解于臺氏液，通過左室楔型心肌組織塊冠狀動脈插管灌流。隨機(jī)分為正常組、LQT2組和AAP10干預(yù)組：正常組（n=10）灌流正常臺式液、LQT2組（n=10）灌流含100Μm d-sotalol的臺式液、AAP10干預(yù)組（n=10）灌流含100Μm d-sotalol和500Nm AAP10的臺式液。
　　

15、在基礎(chǔ)狀態(tài)、AAP10預(yù)處理階段和灌流d-sotalol階段，觀察并記錄左室楔型心肌組織塊自發(fā)性心律失常，以及程序刺激誘發(fā)的左室楔型心肌組織塊心律失常。QT間期為起搏信號到T波下降支與基線交叉點(diǎn)間的距離；動作電位復(fù)極90％時程(APD90)為動作電位0期到復(fù)極至90％振幅的時程；TDR為同一心搏M細(xì)胞和心外膜復(fù)極時間差值。
　　 結(jié)論：縫隙連接激動劑AAP10防止Cx43去磷酸化，減少了犬LQT2模型的跨室壁復(fù)極離散度和心律失常