線粒體基因組complexⅠ變異與甲狀腺腫瘤相關(guān)性研究.pdf

1、目的:
　　 1、本研究通過直接測(cè)序的方法檢測(cè)溫州地區(qū)甲狀腺腫瘤患者線粒體DNAcomplexⅠ變異發(fā)生情況。
　　 2、分析線粒體DNA complexⅠ突變與甲狀腺腫瘤的相關(guān)性及其在甲狀腺腫瘤發(fā)生發(fā)展中的作用。
　　 方法:
　　 1、標(biāo)本采集:選取2008年9月至2009年7月期間在溫州醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院就診的甲狀腺腫瘤患者80例,包括甲狀腺惡性腫瘤60例(甲狀腺乳頭狀癌59例和甲狀腺濾泡狀癌1例)

2、和甲狀腺良性腫瘤20例(其中有1例石蠟病理論斷為腺瘤型結(jié)節(jié)性甲狀腺腫,其它19例為甲狀腺腺瘤)。采集所選患者經(jīng)蘇木素-伊紅(HE)染色的5μm手術(shù)冰凍病理切片3張,同時(shí)采集患者的外周靜脈血標(biāo)本及其臨床資料。
　　 2、DNA提取:光學(xué)顯微鏡下觀察病理冰凍組織切片,區(qū)分腫瘤組織和腫瘤旁正常組織。用試劑盒法提取血液標(biāo)本的全基因組DNA,蛋白酶K法提取腫瘤組織和腫瘤旁組織的全基因組DNA。
　　 3、PCR擴(kuò)增:設(shè)計(jì)11對(duì)互相

3、交叉的引物對(duì)線粒體DNA complexⅠ進(jìn)行PCR擴(kuò)增,PCR產(chǎn)物直接進(jìn)行測(cè)序。
　　 4、數(shù)據(jù)分析:以患者自身的外周靜脈血序列為對(duì)照,應(yīng)用軟件Codoncode Aligner對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行線粒體DNA complexⅠ變異情況分析。進(jìn)一步分析氨基酸改變并運(yùn)用生物軟件進(jìn)行保守性分析,借助蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(cè),探討complexⅠ突變致瘤的分子機(jī)制。
　　 5、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析:結(jié)合患者臨床資料,通過統(tǒng)計(jì)學(xué)方法分析

4、其與線粒體DNAcomplexⅠ突變的相關(guān)性,初步探討線粒體DNA complexⅠ突變?cè)诩谞钕倌[瘤發(fā)生發(fā)展中的作用。
　　 結(jié)果:
　　 1、本研究共檢測(cè)到20個(gè)線粒體DNA complexⅠ突變,14個(gè)為同質(zhì)性突變(70％),6個(gè)為異質(zhì)性突變(30％),其中觀察到2個(gè)突變位點(diǎn)從血液到腫瘤旁組織,再到腫瘤組織異質(zhì)率變化,即由野生型向突變型的轉(zhuǎn)變過程。
　　 2、本研究在60例惡性腫瘤患者中的17例檢測(cè)到突變(突

5、變率為28.33％),在20例良性腫瘤患者中的2例檢測(cè)到突變(突變率為10％),對(duì)惡性腫瘤組和良性腫瘤組兩組突變率進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,結(jié)果無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P值>0.05)。
　　 3、在20個(gè)突變位點(diǎn)中,2個(gè)(包括G3842A和G4974A)為無(wú)義突變,5個(gè)為移碼突變,13個(gè)為錯(cuò)義突變。錯(cuò)義突變中7個(gè)引起氨基酸極性改變,且多位于進(jìn)化上保守的位置,對(duì)二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(cè),發(fā)現(xiàn)C13250T引起了其編碼多肽二級(jí)結(jié)構(gòu)的改變,對(duì)無(wú)義突變和移碼突變

6、的二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(cè),發(fā)現(xiàn)也引起了多肽二級(jí)結(jié)構(gòu)的改變。
　　 4、檢測(cè)到的突變位點(diǎn)在complexⅠ的分布情況為ND1基因4個(gè)、ND2基因2個(gè)、ND3基因1個(gè)、ND4L基因1個(gè)、ND4基因6個(gè)、ND5基因5個(gè)、ND6基因1個(gè)。堿基改變情況,2個(gè)為堿基顛換(包括T-G和C-A顛換各1個(gè)),13個(gè)為堿基轉(zhuǎn)換(包括G-A轉(zhuǎn)換8個(gè),T-C轉(zhuǎn)換4個(gè),C-T轉(zhuǎn)換1個(gè))。
　　 5、在complexⅠ上共發(fā)現(xiàn)203個(gè)多態(tài)性位點(diǎn),其中19

7、7個(gè)位點(diǎn)(97.04％)為堿基之間的轉(zhuǎn)換(包括55個(gè)A-G,50個(gè)G-A,43個(gè)T-C,49個(gè)C-T),6個(gè)為堿基之間的顛換(包括3個(gè)C-A,1個(gè)T-A,1個(gè)T-G,1個(gè)G-C),其中有8個(gè)為未報(bào)道的。
　　 6、線粒體DNA GomplexⅠ突變與甲狀腺腫瘤患者的性別、年齡、家族史、腫瘤大小以及甲狀腺功能指標(biāo)(促甲狀腺素、游離甲狀腺素和游離三碘甲狀腺原氨酸)均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(所有p值均>0.05)。
　　 結(jié)論:

8、　　 1、在本研究發(fā)現(xiàn)的突變位點(diǎn)中,觀察到2個(gè)突變位點(diǎn)從血液到腫瘤旁組織,再到腫瘤組織異質(zhì)率變化,即由野生型向突變型的轉(zhuǎn)變過程,以現(xiàn)有數(shù)據(jù)來看,可初步認(rèn)為線粒體DNA突變參與甲狀腺腫瘤的發(fā)生。
　　 2、在本研究樣本例數(shù)(包括60例惡性和20例良性甲狀腺腫瘤)和地域(溫州地區(qū))范圍內(nèi),線粒體DNA complexⅠ突變?cè)趷盒阅[瘤組和良性腫瘤組兩組間的突變率無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p值>0.05),但檢測(cè)到的錯(cuò)義突變C13250T、移碼突