線粒體DNA突變與甲狀腺腫瘤的相關(guān)性研究.pdf

1、目的:
　　 1、檢測線粒體DNA(mitochondrial DNA，mtDNA)突變在甲狀腺惡性腫瘤(malignant thyroid carcinomas，MTC)和良性腫瘤(benign thyroid adenomas，BTA)患者中的發(fā)生情況;預(yù)測mtDNA錯義突變對線粒體基因編碼蛋白的結(jié)構(gòu)和功能的影響;分析mtDNA蛋白亞基基因突變堿基比。
　　 2、分析mtDNA突變與甲狀腺腫瘤的相關(guān)性。
　　

2、 3、分析MTC和BTA患者mtDNA單體型分布，以期從分子水平揭示線粒體遺傳背景對mtDNA突變和甲狀腺腫瘤的影響。
　　 方法:
　　 1、標(biāo)本采集:在溫州地區(qū)，隨機(jī)采集73例甲狀腺腫瘤患者冰凍病理組織切片，和其外周靜脈血。其中MTC患者冰凍病理組織切片包括腫瘤組織和腫瘤旁組織，BTA患者冰凍病理組織切片只包含腫瘤組織。73例甲狀腺腫瘤患者包括MTC患者55例（甲狀腺濾泡狀惡性腫瘤1例和甲狀腺乳頭狀惡性腫瘤54例）和

3、BTA患者18例（腺瘤型結(jié)節(jié)性甲狀腺腫1例和甲狀腺腺瘤17例），以BTA患者為對照組。同時采集患者的臨床資料。
　　 2、全基因組DNA提取:普通光學(xué)顯微鏡下區(qū)別和分離冰凍病理組織切片（腫瘤組織和腫瘤旁正常組織），采用酚-氯仿法手工提取腫瘤組織和腫瘤旁組織的全基因組DNA和外周血DNA。
　　 3、PCR擴(kuò)增mtDNA:設(shè)計20對重疊連續(xù)引物PCR擴(kuò)增mtDNA全序，并測序，逐個分析每個編碼基因（包括D-Loop區(qū)）。<

4、br>　　 4、突變位點和多態(tài)性位點分析:以劍橋序列為參考，運用軟件CodoncodeAligner篩查mtDNA突變位點和多態(tài)性位點，并以反向測序驗證。應(yīng)用Cluxtal分析變異氨基酸保守性，SOSUI預(yù)測變異蛋白二級結(jié)構(gòu)和PolyPhen-2預(yù)測錯義突變對相應(yīng)蛋白的結(jié)構(gòu)和功能的影響。
　　 5、統(tǒng)計分析:運用統(tǒng)計學(xué)方法分析mtDNA突變與mtDNA單體型之間的關(guān)系，同時結(jié)合臨床資料分析mtDNA突變、mtDNA單體型與甲狀

5、腺腫瘤的關(guān)系。
　　 結(jié)果:
　　 1.55例MTC患者中有32例患者發(fā)生mtDNA突變(58.2％)，共38個mtDNA突變，12個破壞性突變，22個潛在破壞性突變。其中有5個患者攜帶2個或2個以上mtDNA突變。復(fù)合物Ⅰ中發(fā)生22個mtDNA突變，7個為破壞性突變，14個為潛在破壞性突變;復(fù)合物Ⅲ中發(fā)生7個mtDNA突變，1個為破壞性突變，4個為潛在破壞性突變;復(fù)合物Ⅳ中發(fā)生8個mtDNA突變，4個為破壞性突變，4個

6、為潛在破壞性突變;復(fù)合物Ⅴ中發(fā)生1個良性mtDNA突變。共30例MTC患者攜帶34個惡性突變。
　　 2.18例BTA患者中有4例患者發(fā)生mtDNA突變(22.2％)，共4個mtDNA突變。2個為破化性突變，2個為潛在破壞性突變，共4個惡性突變。
　　 3.統(tǒng)計學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，mtDNA惡性突變在MTC組和BTA組之間差異顯著(P=0.017)。在男性和女性組中mtDNA潛在破壞性突變具有顯著性差異(P=0.015)。

7、>　　 4.我們的研究結(jié)果顯示，COI具有最高惡性突變堿基比，為5.19×10-3，CytB具有最高總突變堿基比，為6.13×10-3。
　　 5.55例MTC患者中M單體型22例，其中D亞單體型最多為13例;N單體型33例，其中R亞單體型最多，為25例。18例BTA患者中M和N單體型分別為9例。單體型在MTC患者和BTA患者之間無統(tǒng)計學(xué)差異。
　　 6.統(tǒng)計學(xué)分析MTC組中mtDNA突變在M和N單體型間的差異，結(jié)果顯

8、示mtDNA惡性突變和mtDNA潛在破壞性突變在兩個單體型中具有顯著性差異，P值分別為0.027和0.008。
　　 結(jié)論:
　　 1.本研究發(fā)現(xiàn)甲狀腺腫瘤患者mtDNA突變以惡性突變?yōu)橹鳎蟛糠謵盒酝蛔儼l(fā)生在線粒體呼吸鏈復(fù)合物亞基基因上，特別是復(fù)合物Ⅰ，這可能導(dǎo)致線粒體氧化磷酸化功能異常，增高腫瘤細(xì)胞ROS水平，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞生長。將兩組患者進(jìn)行比較，MTC組mtDNA惡性突變率高于BTA組，且該突變病例數(shù)在兩組間具有顯

9、著性差異(P=0.017)，以現(xiàn)有數(shù)據(jù)推測，mtDNA惡性突變可能增加甲狀腺惡性腫瘤發(fā)病風(fēng)險。經(jīng)突變堿基比分析發(fā)現(xiàn)，COI基因最易遭受惡性突變，而CytB基因是最易發(fā)生突變基因?？紤]到該研究局限于DNA分子水平，因此更深入的研究應(yīng)繼續(xù)開展以驗證該結(jié)論。
　　 2.在本研究樣本例數(shù)和地域范圍內(nèi)，mtDNA潛在破壞性突變在男性患者和女性患者中具有顯著性差異(P=0.015)，男性患者mtDNA潛在破壞性突變率高于女性患者，據(jù)此推測，

10、mtDNA潛在破壞性突變與男性患者可能存在某種相關(guān)性，因受本研究病例數(shù)太少影響，需擴(kuò)大標(biāo)本量進(jìn)一步研究。
　　 3.通過單體型分析后發(fā)現(xiàn)，在55例MTC患者中，mtDNA惡性突變和潛在破壞性突變在M和N單體型間都具有統(tǒng)計學(xué)意義，P值分別為0.027和0.008，且在M單體型中mtDNA惡性突變率和mtDNA破壞性突變率均高于N單體型，據(jù)此推測M單體型可能增加mtDNA惡性突變率和mtDNA破壞性突變率?？紤]到我們所采集標(biāo)本的區(qū)域