腫瘤相關(guān)基因的變異與散發(fā)性結(jié)直腸癌的相關(guān)性研究.pdf

1、散發(fā)性結(jié)直腸癌(Sporadic Colorectal cancer，SCRC)的發(fā)生是一個多基因參與和多階段調(diào)控的復(fù)雜過程，涉及了多種癌基因的激活和抑癌基因的失活，在腫瘤克隆形成的過程中，基因的異常早于形態(tài)學(xué)上的改變，這些異?；虻臋z測有助于腫瘤的早期預(yù)防、診斷和治療。截至到目前，癌基因的激活和抑癌基因的失活導(dǎo)致腫瘤發(fā)生的觀點已得到廣泛的共識，DNA錯配修復(fù)基因異常所導(dǎo)致的微衛(wèi)星不穩(wěn)定(Microsatellite instabili

2、ty，MSI)以及雜合性丟失(Loss of heterozygosity，LOH)可以反映整個基因組的不穩(wěn)定性，LOH還可以用作結(jié)直腸癌的獨立預(yù)后預(yù)測因子。近幾年的研究發(fā)現(xiàn)，micorRNA表達變異與結(jié)直腸癌的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，二者之間關(guān)系的研究成為近幾年來的研究熱點，其作為一類新的診斷標(biāo)記和治療靶點有著巨大潛力，因此，聯(lián)合檢測這些基因的變異將有助于腫瘤的早期發(fā)現(xiàn)，早期預(yù)防和早期治療。蛋白質(zhì)是細(xì)胞內(nèi)各種功能的執(zhí)行者，腫瘤的發(fā)生與細(xì)胞內(nèi)

3、蛋白質(zhì)的變化直接相關(guān)，探索在細(xì)胞內(nèi)有重要作用的蛋白質(zhì)的變化，無疑在腫瘤發(fā)生發(fā)展的研究中具有重要作用。
　　 為綜合探討結(jié)直腸癌發(fā)病過程中DNA水平，mRNA水平，microRNA水平以及蛋白水平上的變異，我們從與結(jié)直腸癌相關(guān)的癌基因，抑癌基因，微衛(wèi)星不穩(wěn)定和雜合性丟失，mRNA和microRNA表達以及變異蛋白高表達體系建立等5個方面探索了散發(fā)性結(jié)直腸癌組織中基因的變化，采用變性高效液相色譜(DenaturingHigh-Per

4、formance Liquid Chromatography, DHPLC)分析方法對抑癌基因P53的第4-9外顯子和APC基因突變富集區(qū)(mutation cluster region，MCR)的第1286～1513密碼子進行突變初篩，采用直接測序和克隆測序方法進行變異類型的驗證，對K-ras第12，13和61密碼子采用PCR產(chǎn)物直接測序的方法檢測突變。同時，使用熒光標(biāo)記PCR和毛細(xì)管電泳方法對錯配修復(fù)基因hMLH1，hMSH2，hP

5、SM1，hPSM2以及抑癌基因P53附近的14個微衛(wèi)星位點進行了MSI分析和LOH檢測，以確定結(jié)直腸癌組織中DNA水平上的聯(lián)合變異頻率。
　　 此外我們還建立了基于SYBR Green l染料法的實時定量PCR的絕對定量檢測體系，在RNA水平上對3種基因的mRNA(AKT2，COX2和EGFR)表達和4種microRNA(miR-21，-31，-96和-135b)的表達進行了檢測，分析了腫瘤組織和正常組織之間的表達差異以及mRN

6、A表達和microRNA表達與臨床病理資料之間的相關(guān)性。
　　 結(jié)果：顯示，微衛(wèi)星DNA的變異頻率是55.8％，P53，APC和K-ras的突變頻率分別為42.3%(22/52),38.5%(20/52)和36.5%(19/52)，聯(lián)合檢測突變的頻率高達80.8%(42/52)。與正常組織相比，腫瘤組織中四種microRNA均出現(xiàn)高表達，統(tǒng)計學(xué)上均有顯著差異(p＜0.05)。miR-135b在Ⅲ和Ⅳ期組織中的表達水平顯著高于Ⅰ和

7、Ⅱ期(p=0.029)，miR-96和miR-135b的表達與結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移顯著相關(guān)(p=0.006和p=0.013)。AKT2，COX2和EGFR基因的mRNA在腫瘤組織和正常組織中的表達無顯著性差異，數(shù)據(jù)顯示這三種基因的mRNA與結(jié)直腸癌發(fā)生的性別，位置，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，分化程度，臨床分期和肝臟轉(zhuǎn)移等臨床病理資料之間不存在相關(guān)性。
　　 眾所周知，蛋白質(zhì)的變化在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中舉足輕重。近來有研究表明，某些蛋白質(zhì)相關(guān)的RNA與D

8、NA序列之間存在廣泛的差異，質(zhì)譜檢測出的蛋白質(zhì)序列與DNA序列也并不完全一致（變異蛋白），為了探討結(jié)直腸癌組織中變異蛋白的產(chǎn)生，我們以K-ras基因為研究對象，構(gòu)建了以慢病毒為載體的K-ras野生型表達載體和六種K-ras突變型表達載體，用上述載體轉(zhuǎn)染cos-7細(xì)胞，篩選出穩(wěn)定高表達K-ras野生型和突變型蛋白的單克隆細(xì)胞株，為以后對變異蛋白進行定性和定量檢測提供了工作基礎(chǔ)。
　　 總之，本研究較全面的分析了結(jié)直腸癌組織和正常組

9、織中微衛(wèi)星DNA，P53，K-ras和APC基因等DNA水平上的變異，發(fā)現(xiàn)80%以上的結(jié)直腸癌組織中都存在一種或幾種DNA的改變，為臨床上結(jié)直腸癌的早期基因診斷提供了理論基礎(chǔ)；檢測了四種結(jié)直腸癌相關(guān)的microRNA基因表達差異，進一步闡明了microRNA在結(jié)直腸癌發(fā)生中的重要作用；成功構(gòu)建了K-ras野生型和變異型的病毒表達載體，篩選得到了多個穩(wěn)定高表達K-ras蛋白的單克隆細(xì)胞株，為以后研究K-ras變異蛋白和結(jié)直腸的關(guān)系奠定了良