利用同源序列法克隆柑橘抗病基因類似物及其初步分析.pdf

1、該研究是根據(jù)已克隆的植物抗病基因保守序列設(shè)計簡并引物,用PCR及RT—PCR的方法從柑橘抗病材料中擴增出抗病基因類似物(resistance gene analog, RGA),并對其中部分RGA的堿基序列及其編碼的氨基酸序列進(jìn)行了分析.同時隨機挑選了一個RGA作為探針,進(jìn)行基因組RFLP分析,所取得的主要結(jié)果如下:⒈建立了提取總RNA的體系.經(jīng)凝膠電泳和紫外分光光度計檢測,其總RNA的質(zhì)量基本達(dá)到分子生物學(xué)實驗技術(shù)要求,能夠用于RT—

2、PCR分析及Northern雜交分析.⒉根據(jù)已知抗病基因保守結(jié)構(gòu)域設(shè)計了多對簡并引物.采用PCR方法,分別從枳殼、九里香、黃皮、國慶1號基因組及枳殼、國慶1號的cDNA中擴增得到以500bp為主的電泳帶(特征帶).分析全部的PCR結(jié)果發(fā)現(xiàn),所有的引物對均能在感病材料或抗病材料基因組DNA及它們cDNA中擴增到以500bp為主帶的電泳圖.因此用現(xiàn)有的簡并引物無法直接對感病和抗病材料進(jìn)行抗病基因的篩選,可能需要進(jìn)一步設(shè)計特異性更高的引物來進(jìn)

3、行篩選.⒊分別對枳殼基因組DNA PCR產(chǎn)物及RT—PCR產(chǎn)物克隆成功的重組子進(jìn)行測序.將得到的25個RGA采用美國國立生物技術(shù)信息中心BLAST程序及DNAsis軟件進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn):所有的RGA與已克隆的部分植物抗病基因(水稻Xal、擬南芥RPS2、煙草N、亞麻L6)在堿基序列和氨基酸序列上均有一定程度的同源性(5.7﹪-25.3﹪);RGAs之間也存在很高的同源性(27.2﹪-100﹪).如何進(jìn)一步對這些RGAs進(jìn)行篩選還有待研究.⒋