馬鈴薯晚疫病抗病基因的分子改造和水稻白葉枯病菌IAA合成途徑相關(guān)基因鑒定.pdf

1、馬鈴薯晚疫病是一種導(dǎo)致馬鈴薯莖葉死亡和塊莖腐爛的毀滅性病害。利用植物抗病基因培育抗病品種是當(dāng)前生產(chǎn)上防控該病害的首選策略。本實驗所利用的基因是從Solanum mochiquense中克隆的抗馬鈴薯晚疫病基因Rpi-mcq1.1、Rpi-mcq1.2和從Solanum venturii中克隆的Rpi-vnt1.1，它們都屬于CC-NBS-LRR 型的抗性基因，序列相似度高達(dá)82％，屬于同一基因家族成員。通過改變結(jié)構(gòu)域、啟動子的方法，探索

2、改良新基因的可行性是本研究的主要目標(biāo)。同時，實驗設(shè)計中還可以幫助尋找抗病基因中決定特異性識別病原菌的結(jié)構(gòu)域，對進(jìn)一步研究病原物與植物之間的互作起到一定作用。
　　 利用結(jié)構(gòu)域互換的方法，使用融合PCR技術(shù)將Rpi-vnt1.1 CC-NB區(qū)和Rpi-mcq1.1 LRR區(qū)組合（簡稱V1M2）、Rpi-vnt1.1啟動子區(qū)與Rpi-mcq1.1、Rpi-mcq1.2 CC-NB-LRR區(qū)組合（簡稱RpiV::mcq1.1和RpiV

3、::mcq1.2），構(gòu)建了3個新的載體。
　　 將三個融合基因連入pCAMBIA1300載體中，轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌工程菌AglⅠ，采用莖段轉(zhuǎn)化法將上述三個載體轉(zhuǎn)化馬鈴薯栽培種Desiree，分別獲得PCR檢測為陽性的轉(zhuǎn)基因植株13株、11株、25株，轉(zhuǎn)化效率分別達(dá)到73％、61％、79％。同時將三個載體轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌工程菌LBA4404。采用葉盤轉(zhuǎn)化法將上述三個載體轉(zhuǎn)化本生煙Nicotiana benthamiana，分別獲得PCR檢測為陽

4、性的轉(zhuǎn)基因植株8株、7株、13株，轉(zhuǎn)化效率分別達(dá)到37％、30％、41％。所獲得轉(zhuǎn)基因植株可用于離體接種馬鈴薯晚疫病菌，對轉(zhuǎn)基因植株進(jìn)行抗病性檢測，以判斷新抗病基因抗病譜變化以及與病原菌互作的結(jié)構(gòu)域。
　　 采用本生煙瞬時表達(dá)技術(shù)，利用農(nóng)桿菌GV3101將Rpi-vnt1.1、Rpi-mcq1.1、Rpi-mcq1.2、V1M2、RpiV::mcq1.1、RpiV::mcq1.2分別與無毒基因Avr2（E2、G3、G1）混合共侵

5、染本生煙，結(jié)果顯示Rpi-mcq1.1、V1M2、RpiV::mcq1.1、RpiV::mcq1.2與無毒基因Avr2的G3、G12菌株混合后產(chǎn)生反應(yīng)一致，均有明顯的HR反應(yīng)，從而驗證Rpi-mcq1.1識別病原物的位點(diǎn)在LRR結(jié)構(gòu)域。尤其有趣的是，Rpi-mcq1.2在低水平表達(dá)下與Avr2不識別，但在換用Rpi-vnt1.1啟動子后能和Avr2識別，與之前35S超表達(dá)結(jié)果相符，說明，Rpi-mcq1.2與Avr2的識別是處于弱蛋白質(zhì)

6、相互作用，為進(jìn)一步分析Rpi-mcq1.1、Rpi-mcq1.2、Rpi-vnt1.1LRR結(jié)構(gòu)域與病原無毒基因Avr2的識別奠定基礎(chǔ)。
　　 同時，在實驗結(jié)果中我們意外的發(fā)現(xiàn)瞬時表達(dá)Rpi-vnt1.1能激發(fā)本生煙產(chǎn)生HR反應(yīng)。為尋找Rpi-vnt1.1自激活現(xiàn)象中發(fā)揮主效功能的結(jié)構(gòu)域，我們構(gòu)建了pCAMBIA1300+Rpi-vnt1.1啟動子-CC-NB區(qū)、pBin19s+35s啟動子+Rpi-vnt1.1CC-NBS區(qū)、

7、pBin19s+35s啟動子+Rpi-vnt1.1LRR區(qū)、pBin19s+35s啟動子+Rpi-vnt1.1CC-NBS-LRR區(qū)、pBin19s+35s啟動子+Rpi-mcq1.1CC-NBS區(qū)、pBin19s+35s啟動子+Rpi-mcq1.1LRR區(qū)、pBin19s+35s啟動子+Rpi-mcq1.1CC-NBS-LRR區(qū)等載體，通過本生煙瞬時表達(dá)技術(shù)，利用農(nóng)桿菌GV3101侵染本生煙。實驗結(jié)果顯示只有Rpi-vnt1.1能自身

8、激發(fā)本生煙產(chǎn)生HR反應(yīng)。由此推測Rpi-vnt1.1自身激發(fā)本生煙產(chǎn)生HR現(xiàn)象可能與Rpi-vnt1.1自身啟動子結(jié)構(gòu)域有著必然的聯(lián)系。為進(jìn)一步解析相關(guān)自激活機(jī)制奠定基礎(chǔ)。
　　 生長素（auxin）是一個至關(guān)重要的植物激素，調(diào)節(jié)植物生長發(fā)育過程中的多個方面。天然植物生長素的主要活性形式是吲哚-3-乙酸(indole-3-acetic acid，IAA)。由水稻白葉枯病菌引起的水稻白葉枯病是世界水稻最重要的病害之一，每年給世界糧

9、食生產(chǎn)造成巨大的損失。近期研究表明IAA不僅調(diào)節(jié)水稻的生長發(fā)育，而且可作為白葉枯病菌侵染水稻的毒性因子。
　　 研究發(fā)現(xiàn)水稻白葉枯病菌也可產(chǎn)生IAA，水稻白葉枯病菌中可能存在一條新的植物病原菌IAA合成途徑。本研究的目的是通過同源重組構(gòu)建水稻白葉枯病菌預(yù)測的IAA合成基因突變體，鑒定水稻白葉枯病菌的IAA合成途徑，并驗證水稻白葉枯病菌產(chǎn)生的IAA在白葉枯病菌侵染水稻過程中所起的作用。
　　 以擬南芥IAA合成路徑中相關(guān)蛋

10、白的氨基酸序列通過BlastP搜索NCBI數(shù)據(jù)庫，找到水稻白葉枯病菌PXO99基因組中存在的同源的腈水解酶家族基因PXO_00867。利用同源重組突變法將PXO99菌株中的PXO_00867基因突變，獲得突變菌株P(guān)XO99△PXO_00867。
　　 利用RT-PCR和基因序列測定法對突變菌株P(guān)XO99△PXO_00867進(jìn)行驗證，確定該菌株中PXO_00867基因發(fā)生了同源重組，導(dǎo)致該基因不能正常表達(dá)。
　　 通過高效

11、液相色譜法檢測用乙酸乙酯萃取得到的野生型PXO99及PXO99△PXO_00867代謝產(chǎn)物中的IAA含量。結(jié)果顯示PXO99△PXO_00867中IAA含量低于PXO99。表明PXO_00867基因在水稻白葉枯病菌PXO99中參與IAA的合成，但是從IAA改變量來看，該基因在IAA合成途徑中所起的作用并不十分顯著。
　　 利用轉(zhuǎn)DR5-GUS的水稻品種日本晴為實驗材料，接種PXO99及PXO99△PXO_00867菌株，采用GU

12、S組織染色法對各個時間段接種的水稻葉片進(jìn)行染色。顯微鏡下觀察染色結(jié)果顯示，同時段的PXO99△PXO_00867侵染的葉片染色較PXO99侵染的葉片顏色略淺，說明突變菌株P(guān)XO99△PXO_00867誘導(dǎo)的水稻IAA合成的量比野生型對照PXO99要低。這一結(jié)果與突變菌株P(guān)XO99△PXO_00867產(chǎn)生的IAA含量比對照略低的結(jié)果想吻合。
　　 通過全波長多功能酶標(biāo)分析儀檢測分析用PXO99△PXO_00867和PXO99接種的

13、水稻葉片的GUS活性。實驗結(jié)果顯示PXO99△PXO_00867侵染的葉片激發(fā)值較PXO99侵染的葉片激發(fā)值低。研究結(jié)果與預(yù)期一致。
　　 同時將PXO99△PXO_00867和PXO99接種不同水稻品種，進(jìn)行病原致病性鑒定。實驗結(jié)果顯示，PXO99△PXO_00867侵染的水稻病斑長度較短，初步說明IAA在病原菌侵染過程中起到一定的作用。
　　 綜上所述，我們通過同源重組方法構(gòu)建了PXO99中IAA合成相關(guān)基因的突變體