抗病毒治療乙肝病人TCR可變區(qū)的深度測(cè)序分析.pdf

1、背景:
　　據(jù)世界衛(wèi)生組織報(bào)道，全球約有20億人曾感染過HBV，并且3.5億人為慢性感染者，每年大約有100萬人死于HBV感染所導(dǎo)致肝硬化、肝衰竭和原發(fā)性肝癌。
　　我國為慢乙肝流行高發(fā)區(qū)域，慢性HBV感染者約9300萬，其中有癥狀需要治療的活動(dòng)性乙型肝炎患者約為2000多萬。慢性乙型肝炎患者的抗病毒療效受病毒自身和宿主等因素的影響，而宿主的細(xì)胞免疫狀態(tài)是治療應(yīng)答的重要因素之一，在肝細(xì)胞的損害及病毒的清除作用中發(fā)揮重要的作用

2、。在急性自限性HBV感染中，針對(duì)HBV的細(xì)胞免疫反應(yīng)比較強(qiáng)，然而在慢乙肝中，針對(duì)HBV的細(xì)胞免疫反應(yīng)要弱得多。感染的病毒通過免疫介到引起肝細(xì)胞的損害，T細(xì)胞功能異?？赡苁菍?dǎo)致HBV感染慢性化的根本原因。目前的慢乙肝主要治療措施是:保肝藥物、抗病毒及免疫調(diào)節(jié)治療，均不能徹底根除乙肝。在HBV的免疫應(yīng)答過程中，特異性細(xì)胞毒性T細(xì)胞(CTL)決定了疾病的轉(zhuǎn)歸及在清除病毒中發(fā)揮了重要作用。T細(xì)胞受體(Tcellreceptor,TCR)決定了C

3、TL特異性，TCR的特性主要取決于可變區(qū)V區(qū)的分子組成。研究TCR的組成特點(diǎn)有助于深入理解HBV免疫應(yīng)答的反應(yīng)機(jī)制。
　　近年來，隨著新一代測(cè)序技術(shù)的飛速發(fā)展和人類基因組計(jì)劃的完成，高通量測(cè)序技術(shù)（High-throughputsequencing）即深度測(cè)序和“下一代”測(cè)序(Nextgenenrationsequencing)具有高通量、操作平臺(tái)簡(jiǎn)易、質(zhì)量高等優(yōu)點(diǎn)，已被應(yīng)用醫(yī)學(xué)的各個(gè)領(lǐng)域。本實(shí)驗(yàn)主要利用慢性乙型肝炎患者治療前后的

4、外周血淋巴細(xì)胞擴(kuò)增β鏈可變受體區(qū)域進(jìn)行高通量測(cè)序，分析受體區(qū)CDR的種類變化及克隆株的變化，從而幫助闡明CHB患者的細(xì)胞免疫應(yīng)答的特點(diǎn)機(jī)制，為揭示慢性乙型肝炎的發(fā)病機(jī)制、有效治療策略提供實(shí)驗(yàn)研究的新思路及技術(shù)平臺(tái)，從而為慢性乙型肝炎的免疫治療提供幫助。
　　目的:
　　利用IonTorrent高通量測(cè)序技術(shù)觀察慢乙肝患者治療前后TCRβ鏈V區(qū)家族性基因的差異性表達(dá)，為深入探討慢乙肝患者的發(fā)病機(jī)制奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。
　　材料

5、與方法:
　　(1)研究對(duì)象:收集2010年3月-2013年12月就診于首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京佑安醫(yī)院門診的臨床治療有效的HBeAg陽性的慢性乙型肝炎患者，所有患者均符合2010年版《慢性乙型肝炎防治指南》的診斷標(biāo)準(zhǔn)。排除合并其他病毒感染、其他原因引起的肝病、慢乙肝不適合抗病毒治療的患者。
　　(2)方法:收集慢乙肝患者的外周血，分離單個(gè)核細(xì)胞;提取總RNA后提取mRNA;逆轉(zhuǎn)錄合成eDNA，后擴(kuò)增TCRβ鏈V區(qū)基因，通過切膠

6、回收后制備文庫高通量測(cè)序。
　　結(jié)果:樣品產(chǎn)生的380，000reads，同時(shí)考慮V、J家族基因，將所有30個(gè)V家族和J家族的基因構(gòu)建數(shù)據(jù)庫，做Blast，發(fā)現(xiàn)有15個(gè)基因上調(diào)，2個(gè)基因(TRBV28_TRBJ1.5，TRBV6_TRBJ2.10)上調(diào)最為明顯，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)論：1.通過高通量測(cè)序，挑選出了TRBV/TRBJ在慢乙肝患者CD8+T細(xì)胞的異常表達(dá)，TRBV10_TRBJ2.1,TRBV10_TRBJ2.