燕窩糖蛋白酶聯(lián)免疫檢測方法的研究.pdf

1、以燕窩中特有成分-燕窩糖蛋白為檢測目標(biāo)，建立了雙抗夾心酶聯(lián)免疫方法(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)檢測燕窩糖蛋白，為燕窩鑒偽提供有效方法。
　　 抗原是影響抗體特異性和效價的重要因素。燕窩經(jīng)60℃水浴提取、醇析得糖蛋白粗品，再經(jīng)DEAE-Sepharose fast flow離子交換層析、Sephacryl S-200凝膠過濾層析分離純化得到了成分相對均一的燕窩特征組分燕窩糖蛋白

2、，經(jīng)SDS-PAGE凝膠電泳測定其分子量約為60 kD，且為單一條帶，再次說明成分相對均一；通過β消去反應(yīng)，證明O型糖肽鍵的存在，證明所得組分為糖蛋白。
　　 以純化的糖蛋白免疫日本大耳白兔，獲得了兔抗燕窩糖蛋白抗血清，效價達(dá)到64000，采用Protein A-Sepharose4B親和層析純化的抗體作為第一抗體，其濃度為3.09mg/mL，以常用的辣根過氧化物酶(horseradish peroxidase，HRP)標(biāo)記抗體

3、得到酶標(biāo)抗體，經(jīng)條件優(yōu)化建立了抗體-抗原-酶標(biāo)抗體的雙抗夾心ELISA方法，其檢測限為0.031μg/mL，線性范圍為0.0625-2μg/mL。
　　 選用常見的燕窩摻假物銀耳、豬皮、淀粉、雞卵清蛋白以及凝集素、牛血清蛋白(BSA)等常見蛋白類物質(zhì)進(jìn)行交叉反應(yīng)實驗，結(jié)果抗體和待測物的交叉反應(yīng)率很低，表明所建立方法特異性強。
　　 采用60℃水浴提取3-4 h，殘渣重復(fù)提取一次，合并兩次提取液，過濾、離心。上清液經(jīng)PBS