雜環(huán)胺酶聯(lián)免疫檢測(cè)方法的研究.pdf

1、本實(shí)驗(yàn)首次建立了針對(duì)食品加工過(guò)程中產(chǎn)生的有害物質(zhì)雜環(huán)胺的酶聯(lián)免疫檢測(cè)方法，并將其應(yīng)用于實(shí)際樣品中。
　　選取了一種結(jié)構(gòu)相對(duì)簡(jiǎn)單、有代表性的的雜環(huán)胺IQ（2-氨基-3-甲基咪唑并[4，5-f]喹啉）作為待測(cè)物來(lái)建立雜環(huán)胺的酶聯(lián)免疫方法。為了降低成本，實(shí)驗(yàn)選擇一種與IQ結(jié)構(gòu)類似物PQ（1H-吡咯[2，3-f喹啉）替代IQ合成半抗原。采用活化酯法將半抗原與BSA偶聯(lián)制備免疫原，成功制備多克隆抗體，與雞卵白蛋白OVA偶聯(lián)制備包被原，與辣根

2、過(guò)氧化酶HRP偶聯(lián)制備酶標(biāo)抗原。經(jīng)過(guò)優(yōu)化確定間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA的最佳工作條件為:包被原包被量0.05μg/孔，抗體稀釋倍數(shù)3500倍，酶標(biāo)二抗稀釋倍數(shù)為20000倍，標(biāo)準(zhǔn)品10 mg L-1，5倍梯度稀釋，封閉液為0.5％脫脂乳粉/PBS，PBS緩沖液的pH為7.4，孵育溫度37℃C，顯色25 min左右，方法的靈敏度(IC50)和檢出限(IC15)分別為71±3μg L-1和3±0.5μg L-1。經(jīng)過(guò)優(yōu)化確定直接競(jìng)爭(zhēng)ELISA的最佳

3、工作條件為:抗體包被量為0.5μg/孔、酶標(biāo)稀釋倍數(shù)為2000倍，封閉液選用0.5％脫脂乳粉/PBS，PBS緩沖液的pH為7.4，方法的靈敏度(IC50)為50±3μg L-1，檢測(cè)限(IC15)為3±0.3μg L-1。用直接競(jìng)爭(zhēng)ELISA法測(cè)定IQ與MeIQ、MelQx、DiMelQx、PhIP、DMIP、AαC的交叉反應(yīng)率，除與MelQ有交叉反應(yīng)率為12％外，與其他種雜環(huán)胺沒(méi)有交叉，說(shuō)明該實(shí)驗(yàn)制備的抗體具有較好的特異性。
　

4、　選擇魚肉松、豬肉、牛肉為樣品進(jìn)行添加回收實(shí)驗(yàn)，分別添加了20μg kg-1，50μg kg-1，150μg kg-1，400μg kg-1四個(gè)濃度，得出魚肉松的添加回收為84.96％-116.23％，豬肉的添加回收為89.79％-107.34％，牛肉的添加回收為89.76％-101.44％，變異系數(shù)均小于20％。所建立的直接競(jìng)爭(zhēng)酶聯(lián)免疫檢測(cè)方法具有很好的準(zhǔn)確性和精密度。使用高效液相色譜法驗(yàn)證本實(shí)驗(yàn)建立的直接競(jìng)爭(zhēng)酶聯(lián)免疫方法，兩種方法檢