黃曲霉毒素B1酶聯(lián)免疫檢測方法研究.pdf

1、本論文分別制備了能夠識別黃曲霉毒素B1的多克隆抗體與單克隆抗體，并建立了檢測黃曲霉毒素B1的酶聯(lián)免疫分析法。
　　用AFB1-BSA作為免疫原，免疫新西蘭兔，獲得抗AFB1多克隆抗體。通過對免疫分析方法工作條件的優(yōu)化，建立了檢測AFB1的間接競爭ELISA方法，最優(yōu)工作條件為:包被原包被量為0.05μg/孔，抗體稀釋倍數(shù)1∶30000，封閉液為0.5％脫脂乳粉，標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液為pH7.4的0.01 M PBS緩沖液。該方法的靈敏度I

2、C50值為1.21±0.08ng/mL，檢測限IC15值為0.06±0.01 ng/mL。建立了檢測AFB1的直接競爭ELISA方法，方法最佳工作條件為:抗體包被量為0.1μg/孔，酶標(biāo)抗原稀釋倍數(shù)為1∶200000，封閉液選擇0.5％脫脂乳粉，標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液為pH7.4的0.01 M PBS緩沖液。該方法的靈敏度IC50值為0.31±0.01 ng/mL，檢測限IC15值為0.04±0.01 ng/mL。經(jīng)間接競爭ELISA方法和直接競

3、爭ELISA方法測定AFB1多克隆抗體的特異性，該抗體與AFG1的交叉反應(yīng)率分別為19.56％和18.29％，與黃曲霉毒素其他結(jié)構(gòu)類似物交叉反應(yīng)率較低。
　　用AFB1-BSA免疫balb/c小鼠，取小鼠的脾細(xì)胞與SP2/0骨髓瘤細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞融合，經(jīng)過細(xì)胞篩選及細(xì)胞克隆獲得了一株能夠穩(wěn)定分泌抗AFB1單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株5A11C10A。將雜交瘤細(xì)胞打入小鼠體內(nèi)誘導(dǎo)產(chǎn)生的腹水純化后得到抗AFB1單克隆抗體。采用單克隆抗體亞型鑒

4、定試劑盒進(jìn)行鑒定，單克隆抗體的重鏈亞型為IgG1，輕鏈亞型為Lambda。利用所得到的AFB1單克隆抗體建立了檢測AFB1的間接競爭ELSIA方法，最佳工作條件為:包被原包被量為0.05μg/孔，抗體稀釋倍數(shù)為1∶15000，封閉液為0.5％脫脂乳粉，標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液為pH7.4的0.01 M PBS緩沖液。該方法的靈敏度IC50值為4.55±0.13 ng/mL，檢測限IC15值為0.74±0.15 ng/mL。建立了檢測AFB1的直接競

5、爭ELISA方法，方法最優(yōu)工作條件為:抗體包被量為0.02μg/孔，酶標(biāo)抗原稀釋倍數(shù)為1∶100000，封閉液選擇0.5％脫脂乳粉，標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液為pH7.4的0.01 M PBS緩沖液。該方法靈敏度IC50值為1.07±0.01ng/mL，檢測限IC15值為0.13±0.01 ng/mL。采用間接競爭ELISA方法和直接競爭ELISA方法測定AFB1單克隆抗體的特異性，與AFG1交叉反應(yīng)率分別為23.90％和26.10％，與AFM1的交