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文檔簡介
1、阿爾茨海默病(Alzheimetr disease,AD)是一種以老年人中進行性記憶障礙和智能衰退為主要臨床特征的中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病。老年斑(senile plaque,SP)、神經(jīng)元纖維纏結(jié)(neurofibrillary tangles,NFT)和神經(jīng)突觸減少或神經(jīng)元丟失是AD的主要病理特征。其中老年斑的主要成分是β-淀粉樣多肽(beta-amyloidpeptide,Aβ)聚集形成的纖維,而Aβ纖維被認為是導致神經(jīng)元損傷及認知
2、功能衰退的主要致病物質(zhì)。針對A B多肽在發(fā)病中的關鍵作用,研究如何阻止Aβ多肽聚集及清除大腦病變區(qū)已形成的Aβ多肽纖維已成為研究AD治療的前沿領域,抗Aβ多肽抗體治療AD也成為AD研究中的一個熱點。動物試驗已證明抗Aβ多肽抗體有清除小鼠大腦中Aβ纖維斑塊防治AD的作用,但至今尚未見人源化抗體有臨床應用的報道。 本課題研究從人源噬菌體單鏈抗體庫中篩選針對Aβ的單鏈抗體可變區(qū)(scFv)基因,并以基因工程構(gòu)建人源抗Aβ全抗體的真核表
3、達體系。主要包括兩部分:第一,從構(gòu)建的人源噬菌體單鏈抗體庫中篩選抗Aβ的scFv基因,在原核細胞中進行可溶性表達,并進行抗體結(jié)合活性和生物學活性檢測;第二,重組IgG全抗體輕重鏈基因及全抗體單鏈基因,構(gòu)建真核表達體系,進行真核細胞表達的初步研究。 一、抗Aβ人源scFv基因的篩選、原核表達與鑒定以Aβ1-42多肽為抗原對抗體庫進行4輪富集篩選:用輔助噬菌體M13K07感染E.coli TG1轉(zhuǎn)化菌,展示出噬菌體形式的抗體庫。將此
4、抗體庫加入到用Aβ1-42多肽包被的96孔板內(nèi),孵育一段時間后洗滌,能夠與抗原特異結(jié)合的scFv噬菌體克隆將被保留在96孔板內(nèi)壁,然后用pH 2.2的甘氨酸-HC1緩沖液將特異結(jié)合的噬菌體洗脫下來,經(jīng)pH8.0的Tris-HC1中和后,感染處于對數(shù)生長期的E.coli TG1,以擴增抗原特異性噬菌體克隆。這樣,經(jīng)過4輪“吸附-洗脫-擴增”的富集過程,抗體庫中與Aβ1-42多肽特異性結(jié)合的噬菌體克隆從第1輪的3.31×104增加到第4輪的
5、7.65×10-2,得到了高度富集,多克隆噬菌體Elisa檢測也顯示了明確的富集效果。隨機挑取80個克隆,用M13K07感染后使scFv展示于噬菌體顆粒表面,ELISA篩選展示有抗Aβ1-42多肽scFv的噬菌體克隆。檢測結(jié)果顯示,得到7個陽性克隆,其中4個克隆ELISA檢測A值高于陰性對照5倍以上,另外3個在2.5~3倍之間。所有陽性克隆均與無關抗原BSA無交叉反應。對其中A值最高的2個克隆(A10、F2)的噬菌體顆粒上清感染E.Co
6、li HB2151,30℃,IPTG誘導表達20h,分別制備胞周質(zhì)、培養(yǎng)基上清和全細胞提取物。經(jīng)12%SDS-PAGE和western blot分析,目的蛋白相對分子量為33kD,主要集中于全細胞提取物,表達量占全菌蛋白60%左右。表達抗體ELISA檢測上清中和全菌蛋白中A值分別高于陰性對照5倍以上,在胞周質(zhì)中高于2倍以上??贵w與Aβ1-40也有結(jié)合反應,但與BSA無交叉反應,顯示scFv抗體對Aβ具有特異性,結(jié)合位點主要在Aβ的N端。
7、表達抗體的生物學活性鑒定示,可與人腦病變組織內(nèi)淀粉樣斑塊中的抗原物質(zhì)Aβ纖維結(jié)合,證明表達的scFv抗體可以應用于體內(nèi)生物學效應實驗。將A10、F2克隆菌測序,用blast分析得到的scFv基因序列,從中分別確定了VH與VL的DNA序列,推導得到的氨基酸序列具有典型的抗體可變區(qū)結(jié)構(gòu)。2個克隆的基因序列一致,表明2個克隆菌可能來源于同一株原始噬粒。 二、抗Aβ人源全抗體基因的重組構(gòu)建、真核表達研究首先對前期獲得的A10克隆scFv
8、基因進行NCBI blast比對,獲得VH和VL基因相應的成熟信號肽基因,并合成信號肽基因,再設計特異引物分別擴增A10克隆的VH、VL、scFv基因和人源IgG的CH、CL、FC段基因,并利用重組PCR(overlap PCR)方法重組IgG全抗體重鏈基因(H信號肽基因+VH基因+CH基因)、IgG全抗體輕鏈基因(L信號肽基因+VL基因+CL基因)和全抗體單鏈基因(H信號肽基因+scFv基因+FC段基因),然后分別克隆到pcDNA3.
9、1真核表達載體內(nèi)。菌液PCR、雙酶切鑒定和DNA測序結(jié)果均顯示,重組的三種基因片段大小與預期一致,基因序列與預期的序列完全一致,讀碼框架和插入真核表達載體的方向完全正確。將IgG全抗體重鏈基因-載體質(zhì)粒和IgG全抗體輕鏈基因-載體質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染CHO細胞,表達IgG全抗體;將全抗體單鏈基因-載體質(zhì)粒轉(zhuǎn)染CHO細胞,表達單鏈全抗體(scFv抗體+FC段)。兩種轉(zhuǎn)染細胞初步的表達產(chǎn)物ELISA結(jié)果未見表達上清與Aβ1-42有陽性反應,后續(xù)工作仍
10、需優(yōu)化細胞表達條件?,F(xiàn)有的工作進展為今后進一步優(yōu)化表達、動物試驗及應用研究奠定基礎。 目前,雖然國內(nèi)外已有幾家篩選到人源抗Aβ抗體的報道,但都仍處于實驗室研究階段,也未見全抗體或進入臨床試驗的報道。我們所得到的抗Aβ序列經(jīng)過比對,與現(xiàn)有已發(fā)表的抗Aβ抗體序列均不同,表明是一個新的抗Aβ抗體?,F(xiàn)已在國內(nèi)申報了專利,同時已完成了全抗體真核表達體系構(gòu)建工作,后續(xù)的優(yōu)化表達工作正在進行。本課題研究工作的結(jié)果有利于今后進一步開展對AD的免
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