CHIP在強(qiáng)直性脊柱炎發(fā)病機(jī)制中的作用.pdf

1、研究背景：強(qiáng)直性脊柱炎(Arlkylosing Spondylitis，AS)是一種以男性為主的與HLA-B27相關(guān)的炎癥性脊柱與關(guān)節(jié)病變，其伴發(fā)的骨質(zhì)疏松癥是該病本身病理變化的一個(gè)方面。AS相關(guān)性骨質(zhì)疏松癥是一種威脅患者生長(zhǎng)發(fā)育和生命健康的嚴(yán)重炎癥性關(guān)節(jié)疾患，其不僅是骨骼系統(tǒng)嚴(yán)重并發(fā)癥之一，還是脊柱畸形，壓縮性骨折以及容易合并脊髓損傷的重要危險(xiǎn)因素。近來(lái)，越來(lái)越多的研究表明，AS相關(guān)的骨質(zhì)疏松是由于骨形成減少所致。研究發(fā)現(xiàn)，在類(lèi)風(fēng)濕關(guān)

2、節(jié)炎等炎癥性疾病中，存在炎癥活動(dòng)性增強(qiáng)與骨代謝失衡，導(dǎo)致骨質(zhì)疏松的發(fā)生。破壞的主要原因是由于炎癥細(xì)胞單核細(xì)胞一巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)和激活所釋放的細(xì)胞因子有關(guān)，其中腫瘤壞死因子(TNF-α)做為一種巨噬細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子具有促進(jìn)骨吸收，和抑制骨形成的作用。大量研究表明，AS患者血清TNF水平明顯升高，可能加速骨質(zhì)破壞，導(dǎo)致骨質(zhì)疏松，低水平的TNF-α可能在預(yù)防和治療AS相關(guān)的骨質(zhì)疏松方面起著重要的作用。但目前對(duì)于TNF-α作用的分子機(jī)制尚不清楚。

3、 CHIP是一種新發(fā)現(xiàn)的泛素連接酶E3酶，分子量大小為35kDa，可降解未折疊蛋白，在蛋白質(zhì)的平衡調(diào)控中起著重要的作用。我們前期的研究發(fā)現(xiàn)，在AS患者的單個(gè)核細(xì)胞中存在未折疊蛋白的過(guò)多積聚，可能是AS發(fā)病機(jī)制之一。故我們推測(cè)在AS患者中CHIP可能存在高表達(dá)，促進(jìn)未折疊蛋白的降解。新近研究發(fā)現(xiàn)，CHIP對(duì)誘導(dǎo)骨形成的重要的細(xì)胞因子BMP-2信號(hào)通路具有負(fù)調(diào)節(jié)作用，進(jìn)而影響骨代謝，抑制骨形成。有研究報(bào)道，TNF可促進(jìn)泛素連接酶E3

4、酶的表達(dá)，而激活泛素蛋白酶體通路。我們推測(cè)TNF可能上調(diào)泛素酶E3酶CHIP的表達(dá)，CHIP的過(guò)表達(dá)對(duì)BMP-2信號(hào)通路調(diào)節(jié)，影響骨代謝過(guò)程。 眾多研究表明，單核-巨噬細(xì)胞在傷口愈合和骨修復(fù)中起著重要的作用，BMP是唯一能夠單獨(dú)誘導(dǎo)骨形成的細(xì)胞因子，其中BMP-2是主要的調(diào)節(jié)骨形成的信號(hào)蛋白，在骨修復(fù)中起重要作用。故認(rèn)為，BMP-2可能在單核-巨噬細(xì)胞中高表達(dá)，具有促進(jìn)骨形成作用。 本研究對(duì)AS患者及THP-1細(xì)胞系中C

5、HIP及BMP-2的表達(dá)進(jìn)行檢測(cè)，探討二者在AS相關(guān)骨質(zhì)疏松發(fā)病機(jī)制中作用的研究，旨在為AS的治療提供新的思路。 方法： 1.運(yùn)用酶聯(lián)免疫吸附法，定量檢測(cè)38例AS患者(25例活動(dòng)期)及28例正常人血清中TNF的含量。 2.取38例AS患者及28例正常人的外周血，分離單個(gè)核細(xì)胞，采用Westernblot，熒光定量PCR等方法對(duì)AS患者及正常人的單個(gè)核細(xì)胞及TNF刺激前后的THP-1細(xì)胞系中CHIP基因及蛋白的定

6、量表達(dá)情況進(jìn)行檢測(cè)。 3.體外試驗(yàn)，將THP-1細(xì)胞中加入10ng/mL的LPS和不加LPS，分為兩組，培養(yǎng)24 h后，分別收集為無(wú)刺激條件培養(yǎng)基和刺激條件培養(yǎng)基，細(xì)胞用于熒光定量PCR檢測(cè)BMP-2基因的表達(dá)；在人骨髓基質(zhì)干細(xì)胞中加入無(wú)刺激條件培養(yǎng)基、刺激條件培養(yǎng)基及含抗bmp-2抗體的無(wú)刺激條件培養(yǎng)基，分為三組。三天后，加入細(xì)胞裂解液以測(cè)其堿性磷酸酶活性。 結(jié)果：1.TNF-α在各組血清中的表達(dá)與ESR的關(guān)系：活動(dòng)期

7、AS組與正常對(duì)照組之間差異有顯著性(P值均<0.05)，穩(wěn)定期AS組與正常組對(duì)照之間差異無(wú)顯著性(P>0.05)。38例AS患者血清TNF水平與紅細(xì)胞沉降率呈顯著正相關(guān)(r值分別為0.669；P值<0.01)。 2.AS患者單個(gè)核細(xì)胞及THP-1細(xì)胞系中CHIP蛋白及基因的表達(dá)：在25例活動(dòng)期AS患者中，CHIP蛋白表達(dá)明顯高于正常組(P<0.05)；13例穩(wěn)定期的AS患者CHIP的表達(dá)較正常組高(P>0.05)，但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異

8、。TNF-α刺激的THP-1細(xì)胞組CHIP的表達(dá)明顯高于無(wú)TNF刺激的THP-1細(xì)胞組(P<0.05).同時(shí)，我們用熒光定量PCR對(duì)CHIP基因的表達(dá)進(jìn)行檢測(cè)，得到與上述相同的結(jié)果。 3.AS患者單核細(xì)胞及THP-1細(xì)胞中BMP-2的表達(dá)：熒光定量PCR方法檢測(cè)了LPS刺激前后的THP-1和AS患者及正常人單個(gè)核細(xì)胞中BMP-2的基因表達(dá)，LPS刺激后THP-1較刺激前THP-1中BMP-2表達(dá)明顯下降，二者比較有顯著差異(P<

9、0.05)。活動(dòng)期AS患者單個(gè)核細(xì)胞中BMP-2的表達(dá)低于正常人組(P<0.05)。 4.堿性磷酸酶活性的測(cè)定：我們?cè)隗w外用刺激的條件培養(yǎng)基、無(wú)刺激的條件培養(yǎng)基和含抗bmp-2抗體的無(wú)刺激條件培養(yǎng)基，對(duì)hMSC進(jìn)行培養(yǎng)，測(cè)其堿性磷酸酶的活性，發(fā)現(xiàn)，無(wú)刺激條件培養(yǎng)基組堿性磷酸酶的活性明顯高于刺激條件培養(yǎng)基組(P<0.05)；含有抗bmp-2抗體的無(wú)刺激條件培養(yǎng)基組堿性磷酸酶活性明顯下調(diào)，低于無(wú)刺激條件培養(yǎng)基組堿性磷酸酶的活性(P<

10、0.05)。 結(jié)論：1.AS患者血清TNF-α水平明顯高于正常人，并且與紅細(xì)胞沉降率有良好的相關(guān)性，提示TNF-α水平可能提示疾病的活動(dòng)期或嚴(yán)重性。 2.CHIP在活動(dòng)期AS患者高表達(dá)，提示CHIP在AS的發(fā)病機(jī)制中可能有重要的作用。 3.體外試驗(yàn)中，TNF-α上調(diào)單核巨噬細(xì)胞系THP-1中CHIP的表達(dá)，提示TNF-α與CHIP之間存在著密切的聯(lián)系，為我們進(jìn)一步探討TNF-α是否對(duì)CHIP調(diào)控BMP調(diào)節(jié)骨形成通