水稻條紋病毒NS3對(duì)灰飛虱Dicer-2蛋白R(shí)NaseⅢ功能域的影響分析.pdf

1、由水稻條紋病毒（Rice stripe virus，RSV）引起的水稻條紋葉枯病給我國(guó)的水稻生產(chǎn)造成了巨大損失。該病毒由介體灰飛虱(Laodelphax striatellus Fallén)傳播，能夠在介體內(nèi)循回增殖且經(jīng)卵傳播給后代。目前，病毒如何適應(yīng)介體灰飛虱的抗病毒免疫反應(yīng)機(jī)制尚不清楚。有研究發(fā)現(xiàn)NS3是RSV的基因沉默抑制子，很可能在RSV侵染灰飛虱的過(guò)程中起到重要的作用。本文以RSV-NS3作為誘餌蛋白篩選灰飛虱酵母雙雜交cD

2、NA文庫(kù)，篩選到一系列灰飛虱體內(nèi)與NS3互作的蛋白因子，并且對(duì)一個(gè)關(guān)鍵因子RNaseⅢ（Dicer-2的一個(gè)功能域）與NS3蛋白之間的相互進(jìn)行了進(jìn)一步分析。
　　1、利用酵母雙雜交系統(tǒng)篩選灰飛虱體內(nèi)與RSV-NS3互作蛋白因子
　　構(gòu)建誘餌蛋白酵母雙雜交載體pGBKT7-NS3，并將其轉(zhuǎn)入酵母菌AH109中，利用酵母雙雜交系統(tǒng)篩選灰飛虱cDNA文庫(kù)，PCR篩選出插入片段大于500 bp的酵母質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌，測(cè)序分析。在Ge

3、nbank數(shù)據(jù)庫(kù)中Blast比對(duì)后，確定插入片段的基因?qū)傩?，最后獲得10個(gè)不同的基因，分別是卵黃原蛋白、含C2結(jié)構(gòu)域蛋白、RNaseⅢ domain、MD-2相關(guān)脂質(zhì)識(shí)別蛋白樣亞型1、DUF1639超家族蛋白、DUF4497超家族蛋白、TweedleE（DUF243超家族蛋白）、熱激蛋白70、類(lèi)Icarapin蛋白、含BTB/POZ結(jié)構(gòu)域蛋白2。
　　2、灰飛虱RNaseⅢ與 RSV-NS3互作驗(yàn)證
　　根據(jù)文庫(kù)篩選結(jié)果，我

4、們主要針對(duì)RNaseⅢ（Dicer-2蛋白的一個(gè)功能域）做了重點(diǎn)研究。分析Dicer-2蛋白功能結(jié)構(gòu)，確定其RNaseⅢ功能域，并克隆其基因，利用酵母雙雜交實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證了RNaseⅢ與NS3蛋白的互作關(guān)系。
　　3、RNaseⅢ的切割活性分析
　　構(gòu)建RNaseⅢ的原核表達(dá)載體，在大腸桿菌BL21(DE3)中進(jìn)行了原核表達(dá)，經(jīng)純化獲得了純化的RNaseⅢ蛋白。純化的RNaseⅢ與dsGFP孵育進(jìn)行切割活性分析，結(jié)果顯示:純

5、化的RNaseⅢ具有切割dsRNA的活性。采用二倍稀釋法逐級(jí)稀釋RNaseⅢ蛋白后進(jìn)行切割活性分析，確定了RNaseⅢ的有效濃度為6 ng/μL。延長(zhǎng)反應(yīng)時(shí)間進(jìn)行切割活性分析，結(jié)果顯示:反應(yīng)時(shí)間延長(zhǎng)有助于RNaseⅢ蛋白切割功能的增強(qiáng)。
　　4、NS3蛋白對(duì)RNaseⅢ切割活性的影響
　　在大腸桿菌BL21(DE3)中原核表達(dá)NS3蛋白，經(jīng)純化獲得了純化的NS3蛋白。在RNaseⅢ切割dsRNA體系中加入純化的NS3蛋白孵育

6、，發(fā)現(xiàn)NS3促進(jìn)了RNaseⅢ對(duì)dsRNA切割。同時(shí)，初步建立了可介導(dǎo)RNA沉默(RNAi)的灰飛虱胚胎提取物(EmbryoLysate)體系，該體系中灰飛虱體內(nèi)的Dicer-2蛋白R(shí)NaseⅢ功能域也具有切割dsRNA的活性。在Embryo Lysate體系中加入NS3與dsRNA孵育，結(jié)果顯示NS3同樣促進(jìn)了RNaseⅢ功能域?qū)sRNA的切割。
　　之前研究報(bào)道NS3不能結(jié)合dsRNA，但可以結(jié)合siRNA，以抑制沉默復(fù)合體