磁標(biāo)記骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞構(gòu)建組織工程軟骨MRI活體示蹤技術(shù)研究.pdf

1、背景： 多種原因所致的關(guān)節(jié)軟骨缺損在醫(yī)學(xué)臨床較為常見(jiàn)，目前所用的保守治療和手術(shù)治療方法均存在明顯缺陷。關(guān)節(jié)軟骨組織工程技術(shù)可為其再生修復(fù)提供新的治療手段。近年來(lái)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs)，因具有良好的體外擴(kuò)增能力、且具有軟骨分化潛能，已成為體外構(gòu)建組織工程軟骨的重要種子細(xì)胞來(lái)源，許多實(shí)驗(yàn)表明移植入宿主體內(nèi)的BMSCs能促進(jìn)宿主體內(nèi)缺損功能的修復(fù)，展示了光明的前景。然而目前困擾關(guān)節(jié)組織工程技術(shù)臨床應(yīng)用的一個(gè)重要難題--對(duì)體內(nèi)原

2、位種子細(xì)胞的研究缺乏有效的識(shí)別和追蹤監(jiān)測(cè)手段，因而難以明確外源性種子細(xì)胞在軟骨缺損修復(fù)中的作用和轉(zhuǎn)歸，體內(nèi)新生軟骨組織的細(xì)胞來(lái)源，細(xì)胞移植術(shù)的療效。因此迫切需要探索一種對(duì)體內(nèi)原位移植細(xì)胞進(jìn)行追蹤和監(jiān)測(cè)的安全、有效、無(wú)創(chuàng)的手段，以促進(jìn)組織工程軟骨修復(fù)關(guān)節(jié)軟骨缺損技術(shù)研究的進(jìn)一步深入。 目的： 本項(xiàng)目擬在課題組既往關(guān)節(jié)軟骨組織工程研究獲得重要進(jìn)展的基礎(chǔ)上，借鑒國(guó)內(nèi)外最新研究成果，研究體外SPIO標(biāo)記種子細(xì)胞BMSCs的適宜方

3、法、磁標(biāo)記物對(duì)種子細(xì)胞生物學(xué)特性的影響、MRI監(jiān)測(cè)體外磁標(biāo)記細(xì)胞的靈敏度、準(zhǔn)確度及MRI活體示蹤自體皮下移植磁化標(biāo)記BMSCs的可行性，最后通過(guò)不同時(shí)相點(diǎn)1.5TMRI在體示蹤種子細(xì)胞在活體內(nèi)的存活、遷徙及分布，以及結(jié)合BrdU細(xì)胞示蹤技術(shù)作為陽(yáng)性對(duì)照，并判定其磁標(biāo)記細(xì)胞的分化轉(zhuǎn)歸過(guò)程，完成其自體移植修復(fù)關(guān)節(jié)軟骨缺損的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)應(yīng)用研究，為關(guān)節(jié)軟骨組織工程種子細(xì)胞的在體示蹤提供一種安全無(wú)創(chuàng)、動(dòng)態(tài)直觀的新技術(shù)和新方法。 方法：

4、 l、體外納米磁標(biāo)記BMSCs的體外細(xì)胞生物學(xué)特性及其MR成像 從兔骨髓中分離培養(yǎng)BMSCs，不同濃度SPIO(50μg/ml、25μg/ml、12.5μg/ml)聯(lián)合硫酸魚(yú)精蛋白轉(zhuǎn)染劑與BMSCs孵育12h，未標(biāo)記細(xì)胞設(shè)為對(duì)照組。普魯士染色和電鏡檢查鑒定細(xì)胞內(nèi)是否含鐵顆粒；胎盼藍(lán)染色檢測(cè)細(xì)胞存活和.MTT法測(cè)定生長(zhǎng)曲線的變化；磁標(biāo)記BMSCs轉(zhuǎn)入各定向培養(yǎng)基中進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)2w后；鑒定磁標(biāo)記BMSCs的多向分化潛能：對(duì)成骨定向

5、誘導(dǎo)組進(jìn)行鈣結(jié)節(jié)茜素紅染色和堿性磷酸酶(ALP)組化染色，對(duì)成脂肪定向誘導(dǎo)組觀察細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化或油紅-O染色，對(duì)成軟骨定向誘導(dǎo)組進(jìn)行番紅-0染色和Ⅱ型膠原免疫組化染色檢測(cè)胞外基質(zhì)的分泌和表達(dá)；應(yīng)用1.5TMR梯度回波T2加權(quán)(GRET2﹡WI)掃描序列和自旋回波T2加權(quán)(SET2WI)掃描序列對(duì)磁標(biāo)記細(xì)胞成像示蹤。 2、MR成像示蹤磁標(biāo)記免BMSCs自體皮下移植 BMSCs經(jīng)體外采用SPIO和BrdU雙重標(biāo)記后，與殼聚糖

6、-甘油磷酸鈉(C-GP)支架復(fù)合植入兔自體大腿皮下，在術(shù)后1h、第5d及2w、4w、8w應(yīng)用0.2TMRORET2﹡WI序列對(duì)磁標(biāo)記細(xì)胞成像行連續(xù)示蹤，掃描后即處死動(dòng)物并取材行組織切片普魯士染色及免疫組化BrdU檢查。實(shí)驗(yàn)組為自體皮下移植SPIO標(biāo)記BMSCs(n=6)，設(shè)立自體皮下移植未標(biāo)記。BMSCs(n=6)和皮下單純注射SPIO組(n=2)為兩組對(duì)照。 3、MR在體成像示蹤磁標(biāo)記的BMSCs修復(fù)兔關(guān)節(jié)軟骨缺損 建

7、立兔膝直徑4mm深約3mm的股骨髁軟骨缺損模型，1周后將經(jīng)SPIO和BrdU雙重標(biāo)記的BMSCs與C-GP支架1ml復(fù)合，然后注射到自體軟骨損傷關(guān)節(jié)腔中，術(shù)后1h、4w、8w及12w應(yīng)用1.5TMRGRET2﹡WI序列對(duì)膝關(guān)節(jié)腔內(nèi)注入的磁標(biāo)記BMSCs進(jìn)行掃描示蹤，并與組織切片普魯士染色及免疫組化BrdU對(duì)照。實(shí)驗(yàn)組為損傷側(cè)膝關(guān)節(jié)注入1ml含1×108個(gè)磁標(biāo)記BMSCs與C-GP支架混懸液；設(shè)立注入1ml含1×108個(gè)未標(biāo)記BMSCs與

8、C-GP支架混懸液、損傷側(cè)膝關(guān)節(jié)不做任何處理為兩組對(duì)照(n=6)。 結(jié)果： 1、體外納米磁標(biāo)記BMSCs細(xì)胞生物學(xué)特性及其MR成像 磁標(biāo)記細(xì)胞普魯士染色和電鏡檢查顯示細(xì)胞胞漿內(nèi)含致密鐵顆粒；胎盼藍(lán)染色和MTT分析測(cè)定生長(zhǎng)曲線證實(shí)磁標(biāo)記對(duì)BMSCs活性和增殖無(wú)影響(P＞0.05)；納米磁標(biāo)記BMSCs在體外具有向成骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞和脂肪細(xì)胞表型誘到的潛能。1.5TMR掃描GRET2*WI序列和SET2WI序列提示與

9、未標(biāo)記細(xì)胞SI相比，1×1O6個(gè)標(biāo)記細(xì)胞、5x105個(gè)標(biāo)記細(xì)胞信號(hào)強(qiáng)度均有不同程度顯著性下降(P＜0.05)其中GRET2*WI的信號(hào)強(qiáng)度衰減率顯著性高于T2WI序列(P＜0.05)。在兩個(gè)序列中1×106(標(biāo)記細(xì)胞)信號(hào)強(qiáng)度衰減率均高于5x105(標(biāo)記細(xì)胞)信號(hào)強(qiáng)度衰減率，但不具有有顯著性差異。 2、MR成像示蹤磁標(biāo)記兔BMSCs自體皮下移植 自體皮下移植的磁標(biāo)記兔BMSCs在GRET2﹡WI序列成像時(shí)產(chǎn)生特征性的低信

10、號(hào)改變至少維持8周。術(shù)后1h兔后肢0.2TMRGRET2*WI序列成像示磁標(biāo)記細(xì)胞在皮下注入部位形成直徑約1.5cm的特異性類(lèi)圓形低信號(hào)影。術(shù)后5d觀察到距注射部位后側(cè)0.5cm處皮下出現(xiàn)孤立的特異性低信號(hào)影，原皮下注射部位特異性低信號(hào)影直徑擴(kuò)大至1.7cm，低信號(hào)強(qiáng)度未見(jiàn)減弱。術(shù)后2w見(jiàn)皮下孤立的特異性低信號(hào)影已與原皮下注射部位特異性低信號(hào)影融合，并呈線性延伸為0.6cm，低信號(hào)區(qū)域直徑擴(kuò)大為2.0cm，侵及肌層。術(shù)后4w見(jiàn)低信號(hào)區(qū)域

11、進(jìn)一步擴(kuò)大。術(shù)后8w見(jiàn)皮下注射部位向周?chē)l(fā)出的低信號(hào)線顯著長(zhǎng)達(dá)1.1cm，低信號(hào)區(qū)域直徑擴(kuò)大為2.6cm，侵及肌肉深層，低信號(hào)強(qiáng)度減弱。MRI信號(hào)改變區(qū)域與組織學(xué)切片普魯士染色及免疫組化BrdU顯示植入細(xì)胞結(jié)果相對(duì)應(yīng)。術(shù)后第5d移植部位見(jiàn)植入細(xì)胞密集，植入物與宿主組織界面周?chē)⒃诔霈F(xiàn)植入細(xì)胞。術(shù)后2w至4w見(jiàn)移植部位與宿主組織界面周?chē)霈F(xiàn)的植入細(xì)胞較前增加，但植入細(xì)胞主要聚集在移植部位內(nèi)，術(shù)后8w移植部位植入細(xì)胞減少，宿主組織內(nèi)出現(xiàn)的植

12、入細(xì)胞較前顯著增加。HE染色觀察到術(shù)后初期在植入?yún)^(qū)域出現(xiàn)炎性反應(yīng)，但術(shù)后1周炎性反應(yīng)消失，所有動(dòng)物的移植部位均未出現(xiàn)切口紅腫和分泌物。 3、MR在體成像示蹤磁標(biāo)記的BMSCs修復(fù)免關(guān)節(jié)軟骨缺損 體外磁標(biāo)記的BMSCs與C-GP復(fù)合注射入關(guān)節(jié)腔后1.5TMRGRET2﹡WI序列成像顯示關(guān)節(jié)腔內(nèi)磁標(biāo)記BMSCs產(chǎn)生彌漫性顆粒狀低信號(hào)影改變至少12w，術(shù)后1h可見(jiàn)關(guān)節(jié)腔內(nèi)出現(xiàn)彌漫性顆粒狀異常低信號(hào)改變，主要分布于和胭窩部位，術(shù)

13、后4w觀察到軟骨缺損部位、軟骨下骨處特異性低信號(hào)影改變。但隨著移植時(shí)間延長(zhǎng)，低信號(hào)強(qiáng)度逐漸減弱，術(shù)后12w軟骨缺損處特異性低信號(hào)影不明顯，而關(guān)節(jié)腔內(nèi)髕上囊、胭窩處結(jié)節(jié)狀低信號(hào)改變?nèi)郧逦嬖?。MRI信號(hào)改變區(qū)域與組織學(xué)切片普魯士染色及免疫組化BrdU顯示植入細(xì)胞結(jié)果相對(duì)應(yīng)。術(shù)后4w見(jiàn)軟骨修復(fù)區(qū)有少量植入細(xì)胞存在，大量植入細(xì)胞主要分布于髕上囊、胭窩處滑膜和軟骨下骨，術(shù)后8w軟骨修復(fù)區(qū)植入細(xì)胞消失，滑膜中植入細(xì)胞數(shù)目亦減少，術(shù)后12w軟骨修復(fù)

14、區(qū)亦未見(jiàn)植入細(xì)胞，而髕上囊滑膜和軟骨下骨部位仍較多存在植入細(xì)胞。 結(jié)論： 1、SPIO聯(lián)合硫酸魚(yú)精蛋白轉(zhuǎn)染劑能成功標(biāo)記BMSCs，磁標(biāo)記對(duì)細(xì)胞存活、增殖及潛在多向分化能力無(wú)影響，磁標(biāo)記細(xì)胞在MR上產(chǎn)生特征性的低信號(hào)改變，臨床1.5TMR成像示蹤標(biāo)記細(xì)胞可行，以GRET2﹡WI序列成像最為敏感。 2、自體皮下移植的磁標(biāo)記兔BMSCs在0.2TGRET2﹡WI序列產(chǎn)生特征性的低信號(hào)改變至少8w，術(shù)后1h、第5d、2w

15、、4w、8w不同時(shí)相MR連續(xù)成像觀察到植入細(xì)胞從皮下移植部位向遠(yuǎn)處遷移并逐漸進(jìn)入宿主組織。術(shù)后2w、4w、8w時(shí)植入細(xì)胞的組織學(xué)改變與MRI結(jié)果基本一致。移植的磁標(biāo)記細(xì)胞在具有免疫功能的皮下未誘發(fā)明顯的免疫反應(yīng)。利用0.2TMR連續(xù)示蹤自體皮下移植的磁標(biāo)記BMSCs活體內(nèi)的分布和遷移是可行的。 3、兔BMSCs經(jīng)SPIO標(biāo)記后仍然具有成軟骨細(xì)胞誘導(dǎo)能力；磁標(biāo)記后植入關(guān)節(jié)腔內(nèi)的BMSCs可以在臨床1.5TMR上產(chǎn)生明顯的低信號(hào)改變

16、至少12w，術(shù)后1h、4w、8w、12w時(shí)不同時(shí)相MR連續(xù)成像觀察到關(guān)節(jié)腔內(nèi)部分植入細(xì)胞向軟骨缺損遷移聚集隨后又逐漸減少，至術(shù)后12w時(shí)軟骨缺損部位植入細(xì)胞消失，此時(shí)植入細(xì)胞主要分布于關(guān)節(jié)腔內(nèi)髕上囊、胭窩、軟骨下骨。術(shù)后4w、8w、12w時(shí)植入細(xì)胞的組織學(xué)改變與MRI結(jié)果基本一致，關(guān)節(jié)腔內(nèi)注入體外擴(kuò)增培養(yǎng)的磁標(biāo)記BMSCs，不能促進(jìn)軟骨缺損修復(fù)。應(yīng)用MRI在體示蹤磁標(biāo)記細(xì)胞技術(shù)可以連續(xù)示蹤組織工程軟骨種子細(xì)胞BMSCs在活體關(guān)節(jié)腔內(nèi)的分