骨髓間充質干細胞與人脫細胞羊膜構建組織工程骨膜的體外成骨研究.pdf

1、研究背景：
　　由創(chuàng)傷、骨病或腫瘤術后等引起的骨缺損是臨床常見的棘手問題。對骨缺損的傳統(tǒng)治療分為自體骨移植、異體骨移植和異種骨移植。但自體移植存在供區(qū)來源有限,且對供區(qū)造成損傷,給病人帶來一定的痛苦;異體和異種骨移植會引起免疫排斥反應和傳播疾病等并發(fā)癥。根據膜內化骨理論,骨膜成骨在骨折愈合、骨缺損修復有著重要作用。因此,應用組織工程的原理和方法來構建真正意義上的人工骨膜進行骨缺損修復和加快骨折愈合的治療可作為一種新的思路。然而,要

2、構建的組織工程骨膜必須具有生理骨膜的結構和功能,既要具備成骨作用的種子細胞,又要具備使種子細胞良好附著、增殖、分化的可降解支架材料。因此,選擇何種種子細胞和支架材料就顯得優(yōu)為重要。
　　目前,組織工程骨膜取得了一定的進展,國內外許多學者應用成骨細胞及骨髓間充質干細胞體外復合殼聚糖、小腸粘膜下層脫細胞基質,修復兔橈骨缺損取得良好效果。對于殼聚糖等可降解支架材料,仍無法與天然膜性材料相比擬,小腸粘膜下層脫細胞基質雖屬于天然結構材料,但

3、大多取材于豬小腸,應用于人的骨缺損修復仍有免疫排斥的風險?，F已證實骨髓間充質干細胞能夠良好的與人羊膜復合。人羊膜取材來源豐富,具備組織相容性好、含多種膠原等特點,可作為理想的支架材料。另一方面,已經應用骨髓間充質干細胞復合人羊膜脫細胞基質成功修復大鼠全層皮膚損傷,但將二者復合構建仿生骨膜可行性如何尚需進一步驗證。
　　目的：
　　探討以人羊膜脫細胞基質為支架材料復合成骨誘導的骨髓間充質干細胞構建組織工程骨膜,以及體外成骨的可

4、行性。為今后構建仿生骨膜動物或人體內成骨提供理論依據。
　　方法：
　　本實驗首先分離SD大鼠(5-7天乳鼠)雙脛骨,用注射器針筒沖洗骨髓,制成單細胞懸液,成功分離并培養(yǎng)出了SD大鼠骨髓間充質干細胞,并對其進行了組織學鑒定;其次,制備出了人脫細胞羊膜,將人脫細胞羊膜固定后行HE染色,證實細胞成分去除干凈;應用掃描電鏡觀察人脫細胞羊膜的結構特;并且以人脫細胞羊膜為支架,將骨髓間充質干細胞復合該支架進行培養(yǎng),體外構建組織工程骨膜

5、,對其進行HE染色和電鏡掃描顯,微鏡下觀察骨髓間充質干細胞在人脫細胞羊膜上復合、生長、擴增情況,并用MTT檢測骨髓間充質干細胞在人脫細胞羊膜(實驗組)和無人脫細胞羊膜(對照組)上增殖情況。實驗分為兩組即骨髓間充質干細胞復合人脫細胞羊膜無誘導劑組(對照組)、骨髓間充質干細胞復合人脫細胞羊膜加誘導劑組(實驗組)。
　　結果：
　　1.用物理和化學方法處理后的人脫細胞羊膜表面無細胞殘留,空隙多,膠原纖維未受損。2.體外成骨誘導培養(yǎng)

6、條件下,BMSCs可呈多層生長,無接觸抑制現象,具有與成骨細胞相似的形態(tài)特征和生長特點,茜素紅染色鈣結節(jié)檢測陽性;成脂誘導培養(yǎng)條件下,BMSCs無接觸抑制現象,逐漸出現空泡,可見脂滴,具有與脂肪細胞相似的形態(tài)特征和生長特點,油紅染色檢測陽性;成軟骨誘導培養(yǎng)條件下,BMSCs無接觸抑制現象,逐漸出現空泡,具有與軟骨細胞相似的形態(tài)特征和生長特點,阿利新藍染色結果陽性。3.在相同條件培養(yǎng)下,實驗組(HAAM組)與對照組(無材料組)的兩組細胞在

7、不同時間點通過分析兩組MTT檢測吸光度值,實驗結果表明,在各個不同的時間點檢測,前4天兩組細胞增殖速度無顯著性差異(p>0.05);第5d,6d兩組增殖細胞量,經組間F檢驗具有顯著性差別(p<0.05),實驗組增殖細胞量比對照組多;第7d,8d兩組增殖細胞量,經組間F檢驗具有顯著性差別(p<0.01),實驗組增殖細胞量比對照組多。4.實驗組可見體外細胞與材料復合培養(yǎng)附著佳,大量的細胞外基質分泌,細胞分化良好、增殖活躍;大體觀察復合材料見

8、顏色較白,組織變硬,組織學和電鏡觀察見有大量骨組織形成;對照組中體外復合培養(yǎng)見細胞與材料粘附良好,細胞生長良好,大體觀察復合材料見顏色和組織硬度不變。
　　結論：
　　1.人脫細胞羊膜具有良好的細胞相容性,不影響B(tài)MSCs的形態(tài),對細胞生長、增殖和功能表達沒有抑制作用。2.BMSCs在體外成骨誘導培養(yǎng)后可表達成骨細胞表型,是一種理想的骨組織工程種子細胞。3.人脫細胞羊膜有良好的生物相容性,可以用作骨組織工程的支架材料構建組織