內(nèi)生真菌與盾葉薯蕷細(xì)胞共生培養(yǎng)合成薯蕷皂苷元研究.pdf

1、盾葉薯蕷(DioscoreazingiberensisC.H.Wright)是我國特有的、具有重要經(jīng)濟(jì)意義的藥用植物，其有效成分薯蕷皂苷元(Diosgenin)是合成甾體激素和甾體避孕藥物藥物的重要原料。隨著甾體藥物消費量增大，薯蕷皂甙元的需求量也越來越大，解決薯蕷皂苷元的資源問題成為國內(nèi)外關(guān)注的熱點。通過植物組織和細(xì)胞培養(yǎng)生產(chǎn)次生代謝產(chǎn)物是解決這一問題的較好方法，但仍存在產(chǎn)率低等問題。植物內(nèi)生真菌是植物微生態(tài)系統(tǒng)中的天然組成成分，在與

2、宿主植物長期共同生活過程中二者建立了互惠共生關(guān)系，內(nèi)生真菌對宿主植物的作用主要表現(xiàn)在促進(jìn)宿主植物的生長發(fā)育，增強(qiáng)宿主植物的抗逆性和促進(jìn)宿主體內(nèi)次生代謝物的形成和積累等方面。
　　 基于植物內(nèi)生真菌在長期進(jìn)化過程中與宿主建立的互惠共生的關(guān)系及其對宿主植物的作用，本研究以盾葉薯蕷為研究材料，從盾葉薯蕷根狀莖中分離得到一株在離體條件下能與盾葉薯蕷細(xì)胞協(xié)調(diào)生長的內(nèi)生真菌RE0105，首次將其引入到植物細(xì)胞培養(yǎng)體系，在離體條件下建立內(nèi)生真

3、菌RE0105與盾葉薯蕷細(xì)胞協(xié)調(diào)生長的共生培養(yǎng)體系，研究內(nèi)生真菌對共生培養(yǎng)細(xì)胞生長、對營養(yǎng)物質(zhì)的要求和利用以及對次生代謝產(chǎn)物合成的影響；同時從內(nèi)生真菌RE0105侵染對盾葉薯蕷細(xì)胞酶促防御反應(yīng)變化、對次生代謝相關(guān)酶活性變化影響以及內(nèi)生真菌調(diào)節(jié)盾葉薯蕷細(xì)胞次生代謝物薯蕷皂苷元合成等角度研究并探討了內(nèi)生真菌RE0105對盾葉薯蕷細(xì)胞生長和薯蕷皂苷元合成影響以及內(nèi)生真菌與宿主細(xì)胞形成互惠共生關(guān)系的機(jī)理。獲得的研究成果如下：
　　 1.

4、首次從盾葉薯蕷根狀莖中分離獲得一株能與離體培養(yǎng)的盾葉薯蕷細(xì)胞協(xié)調(diào)生長的內(nèi)生真菌RE0105。對該內(nèi)生真菌生物學(xué)和化學(xué)特性研究發(fā)現(xiàn)內(nèi)生真菌RE0105生長緩慢，只形成基內(nèi)菌絲和氣生菌絲，不能產(chǎn)生孢子；富含有機(jī)營養(yǎng)的培養(yǎng)基有利于RE0105生長，并且盾葉薯蕷細(xì)胞提取物和適宜濃度生長素(20μmol/LNAA和20μmol/L2，4-D)可顯著促進(jìn)其生長；首次發(fā)現(xiàn)內(nèi)生真菌RE0105能產(chǎn)生與宿主植物相同的次生代謝產(chǎn)物薯蕷皂苷元。此外，對內(nèi)生真

5、菌RE0105ITS1-5.8S-ITS2區(qū)域的堿基序列進(jìn)行了測定并選擇Libertellasp.等19株參考菌株進(jìn)行了系統(tǒng)發(fā)育分析，發(fā)現(xiàn)內(nèi)生真菌RE0105與Libertellasp.具有較近親緣關(guān)系，二者堿基相似性為76.1％。
　　 2.首次建立了離體條件下內(nèi)生真菌RE0105與盾葉薯蕷懸浮細(xì)胞協(xié)調(diào)生長的共生培養(yǎng)體系。建立共生培養(yǎng)體系的條件為以植物細(xì)胞培養(yǎng)基MS培養(yǎng)基為共生培養(yǎng)基，選用胞齡為10～14d細(xì)胞團(tuán)顆粒小的盾葉薯

6、蕷懸浮細(xì)胞(平均粒徑<0.5mm)為種源、細(xì)胞接種量為1/5～1.5/5，在細(xì)胞培養(yǎng)任何時間接入適量的內(nèi)生真菌均可建立內(nèi)生真菌與盾葉薯蕷細(xì)胞協(xié)調(diào)長的共生培養(yǎng)體系。同時利用電鏡技術(shù)研究了內(nèi)生真菌與離體培養(yǎng)的盾葉薯蕷細(xì)胞共生行為，發(fā)現(xiàn)內(nèi)生真菌RE0105既可生長于盾葉薯蕷細(xì)胞外，也能侵入盾葉薯蕷細(xì)胞內(nèi)，并且真菌的侵入沒有引起細(xì)胞裂解死亡，離體條件下二者間為內(nèi)/外共生關(guān)系。
　　 3.首次研究了共生培養(yǎng)體系中內(nèi)生真菌RE0105對盾葉

7、薯蕷細(xì)胞的營養(yǎng)要求和營養(yǎng)物質(zhì)消耗利用的影響。內(nèi)生真菌RE0105侵染并不改變盾葉薯蕷懸浮細(xì)胞對蔗糖、硫酸鎂和氯化鈣需求水平，細(xì)胞生長的最適的蔗糖、硫酸鎂和氯化鈣初始濃度分別為30g/L、370mg/L和660mg/L；但內(nèi)生真菌RE0105提高盾葉薯蕷懸浮細(xì)胞對硝酸銨和磷酸鹽需求水平和降低對硝酸鉀需求水平，單獨培養(yǎng)細(xì)胞生長最適硝酸銨、磷酸鹽和硝酸鉀初始濃度分別為1650mg/L、1.25mmol/L，和2850mg/L，而與內(nèi)生真菌RE

8、0105共生培養(yǎng)細(xì)胞生長所需的適宜硝酸銨、磷酸鹽和硝酸鉀濃度分別為3330mg/L、1.88mmol/L和1900mg/L。內(nèi)生真菌RE0105提高共生培養(yǎng)細(xì)胞對糖、氨態(tài)氮的消耗利用速度，降低對磷營養(yǎng)的吸收利用速率，但內(nèi)生真菌提高了共培養(yǎng)細(xì)胞最終對磷的吸收利用能力。
　　 4.首次研究了共生培養(yǎng)體系中內(nèi)生真菌RE0105對盾葉懸浮薯蕷細(xì)胞生長和薯蕷皂苷元合成的影響。內(nèi)生真菌RE0105對盾葉薯蕷懸浮細(xì)胞生長具有促進(jìn)作用，主要表現(xiàn)

9、在內(nèi)生真菌侵染可提高盾葉薯蕷懸浮培養(yǎng)細(xì)胞的生長速率和生物量積累特別是干物質(zhì)生物量的積累。內(nèi)生真菌RE0105對盾葉薯蕷細(xì)胞薯蕷皂苷元合成能力的影響與內(nèi)生真菌接種時間有關(guān)，在懸浮細(xì)胞培養(yǎng)1d時接種內(nèi)生真菌時，共生培養(yǎng)細(xì)胞薯蕷皂苷元的含量和產(chǎn)量最高，分別比單獨培養(yǎng)細(xì)胞提高了35.11％和41.86％。
　　 5.研究了內(nèi)生真菌RE0105侵染對盾葉薯蕷細(xì)胞酶促防御反應(yīng)變化的影響以及盾葉薯蕷細(xì)胞培養(yǎng)過程中酸性磷酸酶活性變化及其與薯蕷皂

10、元合成關(guān)系。RE0105侵染并未觸發(fā)盾葉薯蕷細(xì)胞抗氧化酶系統(tǒng)參與防御反應(yīng)，但誘發(fā)了宿主細(xì)胞多酚氧化酶、幾丁質(zhì)酶、苯丙氨酸解氨酶參與的防御反應(yīng)。抗氧化酶防御系統(tǒng)在一定程度上的鈍化可能是內(nèi)生真菌與盾葉薯蕷細(xì)胞建立協(xié)調(diào)生長關(guān)系的基礎(chǔ)，多酚氧化酶、幾丁質(zhì)酶和苯丙氨酸解氨酶的激活可能是內(nèi)生真菌提高宿主細(xì)胞提高次生代謝產(chǎn)物薯蕷皂苷元合成能力的基礎(chǔ)。研究還發(fā)現(xiàn)RE0105侵染影響盾葉薯蕷細(xì)胞過氧化物酶同工酶和多酚氧化酶同工酶表達(dá)。與RE0105共生培

11、養(yǎng)細(xì)胞除了表達(dá)二者原有的同工酶譜帶外，還有新的同工酶譜帶表達(dá)。內(nèi)生真菌侵染提高了培養(yǎng)細(xì)胞酸性磷酸酶活性，從而提高細(xì)胞合成薯蕷皂苷元能力，同時發(fā)現(xiàn)細(xì)胞培養(yǎng)過程中酸性磷酸酶活性動態(tài)變化規(guī)律基本能夠反映出薯蕷皂苷元合成的變化規(guī)律，可以將細(xì)胞培養(yǎng)過程中酸性磷酸酶活性變化作為甙元合成能力變化的指標(biāo)。
　　 6.利用HPLC-MS技術(shù)分析比較了盾葉薯蕷細(xì)胞及與內(nèi)生真菌共生培養(yǎng)細(xì)胞合成的代謝產(chǎn)物組成變化。在內(nèi)生真菌與盾葉薯蕷細(xì)胞的相互作用中，