胰島素對大鼠缺氧-復(fù)氧和缺血-再灌注心肌細胞損傷的影響及細胞凋亡信號轉(zhuǎn)導機制研究.pdf

1、第一部分 胰島素對新生大鼠缺氧后復(fù)氧心肌細胞損傷影響及細胞凋亡信號轉(zhuǎn)導機制研究 第一節(jié)新生大鼠體外心肌細胞培養(yǎng)和缺氧/復(fù)氧模型建立 目的： 通過體外培養(yǎng)新生大鼠心肌細胞，構(gòu)建新生大鼠心肌缺氧/復(fù)氧損傷模型，在細胞水平模擬大鼠心肌缺血再灌注(SI/R)損傷，為研究胰島素對新生大鼠缺氧/復(fù)氧損傷影響提供平臺。 方法： 分離新生1-3天的乳鼠心室肌，在培養(yǎng)基中培養(yǎng)3-4天后，行缺氧2h/復(fù)氧4h

2、，建立缺氧/復(fù)氧(anoxia/reoxygenation)心肌細胞損傷模型。在缺氧前、缺氧2h末期和復(fù)氧4h末期利用2，4二硝基苯肼顯色法檢測乳酸脫氫酶(LDH)活性，硫代巴比妥酸顯色法檢測丙二醛(MDA)含量并進行比較，以證實缺氧/復(fù)氧損傷模型構(gòu)建成功。 結(jié)果： 新生1-3天的乳鼠心室肌，在培養(yǎng)基中培養(yǎng)3-4天后，在倒置顯微鏡下可觀察到有搏動的心肌細胞。培養(yǎng)3-4天的心肌細胞在實施缺氧期2h后，LDH和MDA均較缺氧

3、前有所升高(P＜0.01)；而給予復(fù)氧期4h后，LDH和MDA明顯高于缺氧期(P＜0.01)，對照組的上述指標在相應(yīng)時間點未見明顯改變(P＞0.05)。結(jié)論： 通過給新生大鼠體外培養(yǎng)心肌細胞行缺氧2h/復(fù)氧4h后，可明顯造成心肌細胞損傷，以此模擬大鼠心肌缺血再灌注損傷。 第二節(jié)胰島素對新生大鼠缺氧后復(fù)氧誘導心肌細胞凋亡、Akt表達影響及機制研究 目的： 通過新生大鼠缺氧/復(fù)氧損傷模型，觀察胰島素對新生大鼠

4、缺氧后復(fù)氧誘導心肌細胞凋亡、Akt的影響，探討其信號轉(zhuǎn)導機制。 方法： 通過給原代培養(yǎng)乳鼠心室肌細胞行缺氧2h/復(fù)氧4h，建立缺氧/復(fù)氧(anoxia/reoxygenation)心肌細胞損傷模型。于復(fù)氧期開始分別給予0.9％生理鹽水(VC組)、胰島素(INS組)、LY294002(LY組)、胰島素+LY294002(INS+LY組)干預(yù)。于復(fù)氧4h后，利用2，4二硝基苯肼顯色法檢測乳酸脫氫酶(LDH)活性，硫代巴比妥酸

5、顯色法檢測丙二醛(MDA)含量，原位末端標記法(TUNEL)和DNA梯帶法(DNALadder)標測細胞凋亡，免疫印跡法(Westernblotting)檢測磷酸化Akt表達，并比較各組間差異。 結(jié)果： 與VC組相比，INS組中LDH活性、MDA含量、凋亡指數(shù)(AI)顯著降低(P＜0.01)，磷酸化Akt表達明顯增加(P＜0.01)；但上述指標變化可被LY294002(PI3K抑制劑)所抑制。 結(jié)論： 在

6、復(fù)氧早期給予胰島素干預(yù)可顯著地減少缺氧后復(fù)氧所誘導的心肌細胞凋亡，其保護機制與PI3K/Akt信號通路所介導的抗細胞凋亡作用有關(guān)。 第二部分 胰島素對大鼠缺血后再灌注心肌保護作用及其與GIK比較研究 目的： 通過比較胰島素和極化液(GIK)對大鼠缺血后再灌注心肌LDH、MDA、IS/AAR％以及LVEDP的影響，探討胰島素在GIK成分中的作用以及調(diào)節(jié)代謝以外的保護機制。 方法： 結(jié)扎SD大

7、鼠左冠狀動脈前降支(LAD)30min，復(fù)灌LAD180min，建立大鼠缺血再灌注模型，將58只SD雄性大鼠隨機分組為：缺血期組(Ⅰ組，12只)，缺血再灌注組(I/R組，12只)，假手術(shù)組(SHAM組，10只)，胰島素處理組(INS組，12只)，GIK處理組(GIK組，12只)。假手術(shù)組給予冠脈穿線(不結(jié)扎)；缺血期組給予缺血30min，不給予再灌注；其它組分別在再灌注前5min給予生理鹽水、胰島素、GIK干預(yù)。用硫代巴比妥酸顯色法檢測

8、心肌組織中丙二醛(MDA)含量；用2，4二硝基苯肼顯色法檢測血漿中乳酸脫氫酶酶(LDH)活性；用TTC染色檢測心肌梗塞范圍(IS/AAR％)；檢測左室舒張末壓(LVEDP)評價心功能并進行組間比較。 結(jié)果： 1)I/R組中MDA值、LDH值、IS/AAR％和LVEDP均明顯高于Ⅰ組(P＜0.01)；2)與I/R組相比，INS組和GIK組均可明顯降低MDA值(P＜0.01)、LDH值(P＜0.01)，減少心肌IS/AAR％

9、(P＜0.05)，降低LVEDP(P＜0.05)；3)上述指標在INS組和GIK組間未見統(tǒng)計學差異。 結(jié)論： 1)大鼠心肌缺血后再灌注可導致MDA值、LDH值、IS/AAR％和LVEDP升高；2)胰島素在缺血后再灌注損傷中可能具有一定的抗氧化作用；3)胰島素抗心肌缺血后再灌注損傷作用可能不完全依賴于對能量代謝的調(diào)節(jié)。 第三部分 胰島素對大鼠缺血后再灌注心肌細胞凋亡、Bad表達影響及機制研究 目的：

10、 觀察胰島素對大鼠缺血后再灌注心肌細胞凋亡及促凋亡蛋白Bad磷酸化表達的影響，以進一步探討胰島素在缺血再灌注損傷中的抗凋亡機制。 方法： 46只SD雄性大鼠隨機分為四組：1)缺血再灌注對照組(I/R，n=12只)，實施30min缺血/180min再灌注；2)胰島素組(INS，n=12只)，于再灌注期前5min頸靜脈內(nèi)輸注胰島素(60U/L，4ml/kg.h)至灌注期結(jié)束；3)胰島素+LY294002組(INS+L

11、Y，n=12)，再灌注前10min靜脈注射LY294002(0.3mg/kg)，5min后再靜脈輸注胰島素+LY294002(30ug/kg/hr)；4)假手術(shù)組(SHAM，n=10只)：僅給予冠脈穿線，不實施結(jié)扎。實驗結(jié)束后，用原位末端標記法(TUNEL)和DNA梯帶法(DNALadder)標測細胞凋亡，用免疫組化和Western-blotting法檢測磷酸化Bad(pBad)表達。 結(jié)果： 1)與SHAM組相比，I/

12、R組凋亡指數(shù)(AI)明顯增加(P＜0.01)，pBad表達降低(P＜0.05)；2)與I/R組相比，INS組AI值明顯減少(P＜0.01)，pBad表達升高(P＜0.01)；3)與INS組相比，INS+LY組AI值明顯增加(P＜0.01)，pBad表達降低(P＜0.05)。 結(jié)論： 1)缺血再灌注可導致心肌組織pBad低表達；2)胰島素對大鼠在體缺血再灌注心肌有明顯抗凋亡作用；3)PI3K/Akt/Bad途徑可能為胰島素