枸櫞酸預(yù)處理對缺血再灌注大鼠心肌細(xì)胞凋亡和再灌注心律失常的影響及其分子機制研究.pdf

1、目的:
　　目前在心肌缺血再灌注過程中枸櫞酸預(yù)處理的保護作用和相關(guān)機制研究鮮有報道。本實驗應(yīng)用結(jié)扎冠狀動脈前降支法建立在體大鼠冠狀動脈缺血再灌注模型，觀察枸櫞酸預(yù)處理對I/R大鼠再灌注心律失常和心功能的影響，及心肌組織凋亡相關(guān)蛋白表達水平的作用，并通過體外心肌細(xì)胞培養(yǎng)，研究枸櫞酸預(yù)處理在缺血再灌注損傷中減少心肌凋亡的作用及調(diào)控的信號通道，為臨床實踐中減輕心肌缺血再灌注損傷進行有益探索。
　　方法:
　　1.大鼠心肌I/

2、R梗死模型的建立及實驗分組:建立大鼠心肌I/R梗死模型。健康的雄性SD大鼠被隨機化分為3組，每組各15只。I/R組:缺血30min/再灌注120min，再灌注期間經(jīng)股靜脈輸注生理鹽水;I/R+citrate組:同樣方法建立模型，在再灌注前經(jīng)股靜脈輸注枸櫞酸（citrate，0.05mol/L）;Sham組:僅開放胸腔，不進行缺血再灌注。
　　2.接Ⅱ?qū)?lián)心電連接線記錄心電圖，記錄缺血30min、再灌注120min心律失常發(fā)生情況。

3、
　　3.心肌梗死面積和心功能的測量:TTC染色法測量MI方法。對各組射血分?jǐn)?shù)(EF)、左室內(nèi)壓峰值(LVSP)、左室舒張末期壓(LVEDP)、左室內(nèi)壓上升最大變化速率(+dp/dtmax)、左室內(nèi)壓下降最大變化速率(-dp/dtmax)進行檢測。
　　4.血清酶LDH與CK及抗氧自由基指標(biāo)SOD(超氧化物歧化酶)、MDA(丙二醛)與GSH-PX(谷胱甘肽過氧化物酶)的檢測。
　　5.心肌細(xì)胞凋亡和凋亡相關(guān)蛋白casp

4、ase-9、caspase-7、caspase-3、Bcl-2與Bax表達水平的檢測:熒光TUNEL聯(lián)合免疫熒光檢測心肌細(xì)胞凋亡;Western blot法檢測凋亡相關(guān)蛋白caspase-9、caspase-7、caspase-3、Bcl-2與Bax表達水平。
　　6.乳鼠心肌細(xì)胞培養(yǎng)和心肌細(xì)胞缺血再灌注模型建立及實驗分組。
　　7.PI3K/AKT通路及凋亡相關(guān)蛋白的檢測與分析:通過心肌細(xì)胞缺血再灌注模型建立，應(yīng)用West

5、ern blot測定p-PI3K、p-Akt的表達濃度，使用PI3K特異性抑制劑LY294002(20μmol/L)對心肌細(xì)胞進行處理后，檢測其凋亡相關(guān)蛋白caspase-9、caspase-7、caspase-3與Bax蛋白表達水平。
　　結(jié)果:
　　1.與Sham組比較，I/R組再灌注心律失常的發(fā)生明顯增加，再灌注15min后即誘發(fā)出頻發(fā)室性早搏、持續(xù)性室速、室顫等惡性心律失常。當(dāng)采用枸櫞酸0.05mol/L在再灌注前進

6、行預(yù)處理后，各種室性心律失常發(fā)生次數(shù)明顯下降(P＜0.01)。結(jié)果表明，枸櫞酸預(yù)處理可減少心肌缺血再灌注時再灌注性心律失常的發(fā)生率。
　　2.心功能的改變是本病重要表現(xiàn)之一。研究結(jié)果顯示，與Sham組比較，I/R組EF、LVSP、LVEDP、+dp/dtmax和-dp/dtmax指標(biāo)均顯著改變，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)，心功能受損;當(dāng)采用枸櫞酸0.05mol/L在再灌注前進行預(yù)處理后，心功能有明顯好轉(zhuǎn)(P＜0.05)。與S

7、ham組比較，I/R組中LDH與CK兩個指標(biāo)均顯著升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)，心肌受損;當(dāng)采用枸櫞酸進行預(yù)處理后，LDH與CK濃度均有明顯的降低，心肌損傷明顯好轉(zhuǎn)(P＜0.05)。
　　3.采用病理切片對結(jié)果進行驗證，病理結(jié)果顯示I/R組大鼠心臟出現(xiàn)明顯梗死區(qū)，心肌梗死面積為(28.8±6.4)％。與I/R組比較，I/R Citrate組心肌梗死面積明顯縮小，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)。與I/R Citrate組

8、比較，I/R組死亡率顯著升高(P＜0.01)。
　　4.自由基清除障礙也是本病理過程的重要表現(xiàn)之一。與Sham組比較，I/R組SOD與GSH-PX水平降低，MDA水平升高(P＜0.01)，提示在缺血再灌注損傷過程中心肌氧自由基清除能力降低;當(dāng)采用枸櫞酸進行預(yù)處理后，SOD與GSH-PX水平升高，MDA水平降低，心肌氧自由基清除能力有所恢復(fù)(P＜0.05)。
　　5.統(tǒng)計結(jié)果顯示，I/R組心肌組織中TUNEL染色陽性心肌細(xì)胞占

9、(10.37±2.04)％。再灌注前經(jīng)枸櫞酸預(yù)處理后TUNEL染色陽性心肌細(xì)胞占(3.20±0.96)％，與I/R組比較，細(xì)胞凋亡明顯減少(P＜0.01)。提示，枸櫞酸預(yù)處理具有顯著的減少心肌細(xì)胞凋亡的作用。
　　6.對凋亡相關(guān)蛋白caspase-9、caspase-7、caspase-3、Bcl-2與Bax蛋白表達水平進行檢測，發(fā)現(xiàn)I/R組心肌組織caspase-9、caspase-7、caspase-3與Bax蛋白表達顯著升高

10、，Bcl-2蛋白表達水平明顯降低(P＜0.001)。與I/R組比較，再灌注前經(jīng)枸櫞酸預(yù)處理后，caspase-9、caspase-7、caspase-3及Bax蛋白表達水平明顯減低(P＜0.001)，Bcl-2蛋白表達水平明顯升高(P＜0.001)。這也顯示了枸櫞酸預(yù)處理具有明顯減少心肌細(xì)胞凋亡的效應(yīng)。
　　7.枸櫞酸預(yù)處理心肌細(xì)胞后，能夠激活PI3K/Akt信號通路，與I/R組比較，I/R+citrate組p-PI3K與p-Ak

11、t水平明顯升高(P＜0.01)。為深入探討枸櫞酸預(yù)處理減少心肌細(xì)胞凋亡是否通過上調(diào)PI3K/Akt信號通路而實現(xiàn)，使用PI3K特異性抑制劑LY294002(20μ mol/L)對處理心肌細(xì)胞。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與I/R+Citrate組比較，I/R+Citrate+LY294002組各凋亡相關(guān)蛋白的表達水平均有顯著改變(P＜0.01)。
　　結(jié)論:
　　1.枸櫞酸預(yù)處理降低缺血再灌注大鼠心肌損傷，保護心功能，減少再灌注性心律失常的嚴(yán)

12、重程度和發(fā)生率。
　　2.I/R心肌細(xì)胞凋亡數(shù)量增加，心肌梗死面積擴大，枸櫞酸預(yù)處理能夠減少心肌細(xì)胞凋亡的發(fā)生，縮小心肌梗死面積，改善心臟舒縮功能。
　　3.枸櫞酸預(yù)處理顯著提高心肌細(xì)胞的p-Akt水平，激活缺血再灌注心肌PI3K/Akt信號通路。使用PI3K特異性抑制劑LY294002，可以抑制p-Akt的升高，從而抑制枸櫞酸預(yù)處理的對缺血再灌注心肌的保護作用。
　　4.枸櫞酸預(yù)處理激活缺血再灌注心肌PI3K/Akt