皺紋盤鮑表達序列標(biāo)簽及免疫相關(guān)基因的克隆與表達研究.pdf

1、本論文以皺紋盤鮑為研究對象，構(gòu)建了其肝、腎組織的cDNA文庫，并對文庫進行了一定規(guī)模的測序。利用EST提示的信息成功克隆了與免疫相關(guān)的三個基因，神經(jīng)肽Y受體、半乳糖凝集素和同種異體移植炎癥因子-1。此外，還從EST序列中開發(fā)了15個微衛(wèi)星標(biāo)記，并利用這些標(biāo)記對皺紋盤鮑兩個養(yǎng)殖群體的多樣性進行了分析?，F(xiàn)將結(jié)果摘要如下： (1)以皺紋盤鮑的肝、腎組織為材料，構(gòu)建了cDNA文庫。經(jīng)測定，庫容為5.24×10<'5> cfu/mL、插入

2、片段大小為0.8～2.5 Kb。挑取文庫中1445個重組克隆進行序列測定，得到了1282條高質(zhì)量的EST。聚類分析得NT 876個基因聚類，同源性對比發(fā)現(xiàn)有393個獲得了功能提示，占總數(shù)的45％，其中與免疫相關(guān)的基因聚類有63個。 (2)根據(jù)EST提供的信息，采用RACE技術(shù)成功克隆了審經(jīng)肽Y受體基因的全長cDNA序列。該序列全長1534 bp，包含一個59 bp的5'-UTR和396 bp的3'-UTR，開放閱讀框長1053

3、bp，編碼350個氨基酸。生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，此NPY受體具有7個α跨膜螺旋，N端在胞外，被糖基化，C端在胞內(nèi)，被磷酸化，在ILG-NI處有典型的信號肽裂解位點，裂解后釋放了一個具有309個氨基酸的成熟多肽。RT-PCR研究顯示該NPY受體在不同組織中的表達有明顯的差異，用鰻弧菌進行刺激，發(fā)現(xiàn)NPY受體在鰓和肝臟中的表達量有明顯的上升。 (3)成功克隆了半乳糖凝集素(Galectin)的全長cDNA序列。該序列全長2889bp，

4、包含一個84 bp的5'-UTR和1868bp的3'-UTR，開放閱讀框長921bp，編碼307個氨基酸。生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)Galectin具有兩個功能域，與哺乳動物具有很高的同源性。鰻弧菌刺激后，Galectin在肝臟中的增加量最大。不同時間的刺激結(jié)果顯示，肝臟在12 h表達量達最高，24 h恢復(fù)至正常水平。 (4)成功克隆了同種異體移植炎癥因子-1(AIF-1)的全長序列。該序列全長1302bp，包含一個42 bp的5'-U

5、TR和804 bp的3'-UTR，開放閱讀框長456bp，編碼151個氨基酸。分析發(fā)現(xiàn)該基因具有一個EF-手形功能域，該功能域可以和Ca<'2+>結(jié)合而被活化。差異表達顯示，皺紋盤鮑AIF-1在鰓和肝臟中都有很高的表達量。不同時間的刺激結(jié)果顯示，肝臟在8 h后表達量達最高值，24 h恢復(fù)至正常水平。 (5)通過Tandem repeats finder軟件在獲得的EST中查找微衛(wèi)星位點，使用 Primer Premier 5.0