Th17細(xì)胞及其相關(guān)細(xì)胞因子與慢性HBV感染疾病進(jìn)展的相關(guān)研究.pdf

1、背景：
　　慢性乙型肝炎病毒（Hepatitis B Virus,HBV）感染嚴(yán)重威脅人類健康。目前認(rèn)為，宿主免疫調(diào)控紊亂是導(dǎo)致HBV感染慢性化的重要原因，并與疾病進(jìn)展密切相關(guān)。T細(xì)胞亞群及其細(xì)胞因子在維持機(jī)體免疫平衡中起著重要作用。T細(xì)胞亞群通常包括Th1、Th2、Th17、Treg等，其中Th17主要參與機(jī)體的促炎反應(yīng)。IL-23是促進(jìn)幼稚輔助性T細(xì)胞向Th17分化的關(guān)鍵因子，成熟后的Th17細(xì)胞通過產(chǎn)生IL-17、IL-21

2、、IL-22等細(xì)胞因子發(fā)揮免疫調(diào)控作用。大量研究表明，Th17及其相關(guān)細(xì)胞因子參與了多種肝臟疾病的發(fā)生發(fā)展。本課題組長期致力于慢性肝病的綜合防治。我們前期研究發(fā)現(xiàn)：IL-17在乙肝肝硬化失代償期患者外周血中顯著升高；患者接受自體外周血干細(xì)胞移植治療后，隨著肝功能的逐漸恢復(fù)，外周血IL-17水平也顯著降低。進(jìn)一步的動物實(shí)驗(yàn)表明：外源性IL-17能夠加重CCl4誘導(dǎo)的肝損傷，利用單克隆抗體中和IL-17可有效減輕肝損傷；干細(xì)胞治療可有效減輕

3、動物肝損傷，外源性IL-17能夠在一定程度上抵消干細(xì)胞的治療效應(yīng)。由此提示，IL-17在肝臟損傷及修復(fù)中起著重要的調(diào)控作用。由于IL-17主要由Th17產(chǎn)生，那么，Th17及其其他相關(guān)細(xì)胞因子（包括IL-23、IL-21、IL-22等）在慢性乙型病毒性肝病進(jìn)展過程起什么作用？自體外周血干細(xì)胞治療能否影響Th17以及IL-23、IL-21、IL-22等細(xì)胞因子？查閱文獻(xiàn)尚未見相關(guān)研究報道。
　　目的：
　　1.明確Th17及其

4、相關(guān)細(xì)胞因子在慢性乙型病毒性肝病進(jìn)展中的變化；
　　2.探討自體外周血干細(xì)胞治療對乙肝肝硬化失代償期患者外周血Th17及其相關(guān)細(xì)胞因子的影響。
　　方法；
　　1.研究對象
　　本研究方案經(jīng)過我院倫理委員審核并批準(zhǔn)。課題分兩部分進(jìn)行，所有對象均簽署知情同意書。
　　第一部分研究對象，包括健康志愿者、慢性乙型病毒性肝炎患者、乙肝肝硬化代償期患者和失代償期患者各50例。慢性乙型病毒性肝炎和乙肝肝硬化的診斷符合我

5、國《病毒性肝炎防治方案》和《慢性乙型肝炎防治指南》診斷標(biāo)準(zhǔn)。
　　第二部分研究對象，符合乙肝失代償期肝硬化診斷標(biāo)準(zhǔn)、自愿在我科接受自體外周血干細(xì)胞移植治療的20例患者。所有患者均隨訪至少1年，均有完整的基線資料和隨訪資料。
　　2.實(shí)驗(yàn)樣本
　　對第一部分研究對象，采集其空腹?fàn)顟B(tài)時的外周血20ml。對第二部分研究對象，分別采集其接受干細(xì)胞治療前及治療后3月、6月和12月的外周血，每次20ml。所采集的血液樣品置于肝素抗

6、凝管中，即刻低速離心分離血細(xì)胞和血漿。所獲血漿樣品于液氮中快速冷凍后保存于-80℃?zhèn)溆谩Ｑ?xì)胞經(jīng)淋巴細(xì)胞分離液分離，收獲其中的單個核細(xì)胞，經(jīng)程序化冷凍后保存于液氮備用。
　　3.檢測方法
　　細(xì)胞因子檢測：采用商品化ELISA試劑盒，按照說明書提供的方法檢測血漿樣本中的IL-17、IL-21、IL-22、IL-23。
　　T細(xì)胞亞群檢測：將凍存的單個核細(xì)胞解凍后置于培養(yǎng)板中，以PMA、Ionomycin和Monensi

7、n對細(xì)胞進(jìn)行處理；以CD4、IL-17、IL-22、IFN-γ對細(xì)胞進(jìn)行多重標(biāo)記，并借助流式細(xì)胞儀分析Th17和Th22百分?jǐn)?shù)。
　　4.統(tǒng)計(jì)學(xué)分析
　　借助SPSS17.0軟件進(jìn)行。計(jì)數(shù)資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，兩組間比較采用t檢驗(yàn)；計(jì)量資料采用Kruskal-Wallis H檢驗(yàn)。p<0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)果：
　　1.與健康志愿者相比，慢性乙型病毒性肝炎患者和乙肝肝硬化患者外周血IL-17、IL-2

8、1、IL-22、IL-23水平均顯著升高。并且，乙肝肝硬化患者外周血四種細(xì)胞因子的水平顯著高于慢性乙型病毒性肝炎患者，乙肝肝硬化失代償期患者四種細(xì)胞因子顯著高于代償期患者，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　2.與健康志愿者相比，慢性乙型病毒性肝炎患者和乙肝肝硬化患者外周血Th17和Th22百分?jǐn)?shù)均顯著升高。并且，乙肝肝硬化患者外周血Th17和Th22百分?jǐn)?shù)顯著高于慢性乙型病毒性肝炎患者，乙肝肝硬化失代償期患者Th17和Th22百分?jǐn)?shù)顯著高

9、于代償期患者，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　3.隨訪分析表明，在接受自體外周血干細(xì)胞治療3個月后，乙肝失代償期肝硬化患者的肝功能指標(biāo)（包括血漿白蛋白、轉(zhuǎn)氨酶、總膽紅素和MELD評分等）逐漸恢復(fù)正常。
　　4.在接受自體外周血干細(xì)胞治療3個月后，患者外周血IL-17、IL-21、IL-22、IL-23的水平逐漸降低，在治療后6月時達(dá)到最低，與治療前相比差異顯著。并且，患者的IL-23水平與IL-17、IL-21、IL-22水平之間

10、具有顯著的正相關(guān)性。
　　結(jié)論：
　　慢性乙型病毒感染后，隨著疾病的進(jìn)展，外周血Th17及其相關(guān)四種細(xì)胞因子均呈逐漸增高趨勢；自體外周血干細(xì)胞治療能夠顯著改善乙肝肝硬化失代償期患者的肝功能，患者的外周血Th17及其相關(guān)細(xì)胞因子水平也隨之顯著降低。上述結(jié)果提示，Th17及其相關(guān)細(xì)胞因子可能在慢性乙型病毒性肝病發(fā)展過程中起著重要的促進(jìn)作用，自體外周血干細(xì)胞移植有可能通過下調(diào)Th17及其相關(guān)細(xì)胞因子水平而促進(jìn)乙肝肝硬化患者肝功能的