Th17細(xì)胞相關(guān)因子的表達(dá)純化及吸附評價.pdf

1、自身免疫性疾病是指機體對自身抗原發(fā)生免疫反應(yīng)而導(dǎo)致自身組織損害所引起的疾病，該疾病的發(fā)病機理比較復(fù)雜，尚未研究清楚，目前臨床上還沒有有效成熟的治療方法。之前一直認(rèn)為自身免疫性疾病與機體內(nèi)T輔助細(xì)胞的兩個亞群Th1細(xì)胞和Th2細(xì)胞有關(guān)，當(dāng)這兩個亞群相互作用失去平衡即引起疾病的產(chǎn)生，但是隨著研究的深入，發(fā)現(xiàn)這種傳統(tǒng)觀念無法解釋一些疾病的發(fā)生發(fā)展，而相應(yīng)的一種新的細(xì)胞亞群(Th17細(xì)胞亞群)的發(fā)現(xiàn)能很好的解釋許多疑惑，這種新的細(xì)胞亞群打破了之

2、前的傳統(tǒng)概念，被發(fā)現(xiàn)與自身免疫性疾病有著更為密切的關(guān)系，近些年來受到了很多研究學(xué)者的關(guān)注。Th17細(xì)胞主要相關(guān)效應(yīng)因子為IL-17、IL-6、TNF-α，從臨床上疾病治療角度出發(fā)，關(guān)于Th17細(xì)胞相關(guān)因子的檢測與去除具有重要的實際意義。本論文對Th17細(xì)胞的主要效應(yīng)相關(guān)因子進(jìn)行表達(dá)純化，然后通過典型吸附劑對其吸附評價。
　　本研究主要內(nèi)容包括：⑴TNF-α的表達(dá)純化。構(gòu)建表達(dá)載體pET23a-TNF-α，轉(zhuǎn)入宿主BL21(DE3)

3、中，通過IPTG誘導(dǎo)進(jìn)行蛋白表達(dá)。通過優(yōu)化條件，得到蛋白最優(yōu)表達(dá)條件為:LB培養(yǎng)基培養(yǎng)菌體，37℃，175rpm活化12h，以1％接種量轉(zhuǎn)接放大培養(yǎng)3h，用0.1 mM IPTG誘導(dǎo)培養(yǎng)4h，目的蛋白的表達(dá)量約為1.2 mg/mL，占總蛋白56％。將菌體超聲破碎，0.2％PEI(w/w)沉淀，40％飽和硫酸銨沉淀，Ni-NTA親和樹脂層析后，樣品純度達(dá)95％以上。⑵IL-6，IL-17A/17F的表達(dá)。通過構(gòu)建表達(dá)載體pPIC9K-IL

4、-6，pPIC9K-IL-17A，和pPIC9K-IL-17F，電轉(zhuǎn)入GS115宿主體內(nèi)，通過RDB培養(yǎng)基，MM/MD培養(yǎng)基，PCR擴增篩選鑒定His+Mut+表型，對陽性轉(zhuǎn)化子用YPD培養(yǎng)基于30℃，225rpm活化14-16h，以1％接種量轉(zhuǎn)入BMGY培養(yǎng)基于30℃，225 rpm培養(yǎng)至OD600為2-6，接著轉(zhuǎn)入BMMY培養(yǎng)基使OD600為1左右，25℃，225rpm培養(yǎng)96 h，每24 h甲醇誘導(dǎo)一次，誘導(dǎo)量為終濃度1％，IL-